强旱生植物霸王液泡膜氢焦磷酸酶基因和植物表达载体及其植株遗传转化方法

摘要

本发明涉及从中亚荒漠特有的多浆旱生植物霸王(Zygophyllumxanthoxylum)中克隆的液泡膜氢焦磷酸酶基因ZxVP1-1和两个核心片段ZxVP1-2、ZxVP1-3，以及该基因的植物表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1和含有该表达载体的工程农杆菌GV3101。本发明属于分子生物学和生物技术领域，主要用于农作物的遗传改良，可以提高农作物的耐盐、抗旱、抗寒、耐贫瘠和生物量等性状，具有重要的社会、经济和生态效益。

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及从中亚荒漠特有古老的强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)中克隆的液泡膜氢焦磷酸酶基因ZxVP1-1，以及该基因的植物表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1和含有该表达载体的工程农杆菌GV3101及其植株遗传转化方法。 

背景技术：

干旱和土壤盐渍化是制约全球农牧业生产的两个最主要不利因素。目前，世界上干旱区总面积约为61亿公顷，约占全球陆地面积的40％(《环球时报》2009)。而且，由于温室气体排放，气温升高，水分蒸发加剧，致使某些半湿润地区也变成了干旱地区。此外，由于干旱和半干旱地区的强烈蒸发，使这些地区的土壤中富集了大量盐分而使土壤盐渍化、荒漠化。另外，据统计，全球还有各种盐渍土地约9.5亿公顷(Kovda & Szabolcs，Modellingof Soil Salinization and Alkalization.1979)；而且，由于耕地的次生盐渍化，盐渍土地面积也在不断增加。随着社会不断进步，人口急速膨胀，世界粮食出现危机；因此，在耕地资源愈趋匮乏和全球生态日益恶化的形势下，对大面积存在的干旱盐渍土地资源进行开发利用变得愈加迫切。 

然而，令人遗憾的是，全球植物物种的99％，尤其是农作物对干旱和盐渍环境的耐受性都不强(Flowers T J and Colmer T D.2008.New Phytol.179(4)：945-63；Xiong L M and Zhu J K.Salt Tolerance.The ArabidopsisBook.2002)；因此，提高农作物以及其它植物的耐盐抗旱性是开发利用大面积存在的干旱盐渍土地资源的重要途径之一，也是解决粮食危机和应对全球气候变暖的重要手段。然而目前作物性状的改良主要依赖于传统育种。由于遗传物质的杂合性和优良品种数以及其有限的抗逆性的限制，传统育种不但费时长而且成功几率小。庆幸的是：一方面，植物基因工程可以克服传统育种的缺陷，突破物种间优良抗逆基因资源转移的障碍，培育出传统育种方法所不能培育的新品种(系)；另一方面，干旱盐渍生境中的植物在漫长的生命史中演化出适应不良生境的独特机制，进化出大量对干旱盐渍生境具有强抗性的独特抗逆基因资源，这为农作物抗旱耐盐性的遗传改良带来了新曙光。 

为了在干旱盐渍环境中生存，植物细胞必须维持很低的渗透势以保证在 干旱条件下根系能从土壤中吸收水分以及减少叶片细胞的水分散失。尽管植物可以合成大量“兼性”有机溶质，如糖类(蔗糖)、糖醇类(山梨醇)、氨基酸类(脯氨酸)、甲基化脯氨酸类化合物(甲基脯氨酸)、甜菜碱类(甘氨酸甜菜碱)和甲基磺酸化合物(β-二甲基巯基丙酸盐，DMSP)(Gasegawa PM，Bressan R A，Zhu J K，Bohnert H J.2000.Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology.51：463-499；Rhodes D，HansonA D.1993.Annual Review of Plant Phys iology and Plant MolecularBiology 44：357-384)等进行渗透调节；但其不仅消耗了大量的C源和N源，而且在合成过程中还需要耗费相当的能量。因此，合成有机渗透调节物质并不是一种理想的渗透调节方式。 

研究表明，干旱盐渍生境中的植物可利用大量无机离子如Na⁺、K⁺等进行渗透调节，如Wang等发现霸王可从含盐量极低的生境中吸收并积累大量的Na⁺以降低细胞渗透势来适应极端的干旱环境(Wang S M，Wang Y R，ChenH，et al.2004.J.Arid Environ.56：525539)。霸王作为一种典型的荒漠多浆旱生植物，广泛分布于我国西北荒漠(赵一之，朱宗元.2003.云南植物研究.25(2)：113 121)，在其漫长的生命进化史中孕育出大量而独特的抗逆基因资源，对极端环境如强光照、极度干旱、强烈温差和贫瘠的荒漠土壤等具有很强的适应性(周向睿，周志宇，吴彩霞.2006.草业科学，23(6)：38-41)。因此，本发明的动因就是：利用现代生物技术，从具有特殊适应机制的荒漠植物霸王中挖掘其特异的抗逆基因资源，用于农作物和优良牧草抗逆性的遗传改良，使其能够更有效地利用土壤中的Na⁺进行渗透调节，增强其适应干旱盐渍等不良生境的能力。 

由于Na⁺会危害细胞质内各种代谢酶的活性(Blumwald E.2000.CurrOpin Cell Biol.12(4)：431-4)，因此，植物细胞需要将进入细胞质的Na⁺进行区隔以维持正常的生长代谢活动(Frommer W B and Rentsch D.1999.Science.285：1222-1223)。由于液泡占成熟细胞体积的80-90％(Schmidt UG，Endler A，Schelbert S，et al.2007.Plant Physiology.145：216-229)，因此液泡是大量有害物质如Na⁺等的理想区隔场所。研究表明，离子区域化的实现主要依赖各种离子的膜转运蛋白和为离子膜转运蛋白提供转运动力的质子泵。因此，提高膜转运蛋白和膜质子泵的活性或增加其表达量均可使离子转运效率提高。液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(H⁺-pyrophosphatase，H⁺-PPase，EC3.6.1.1)是位于液泡膜上的一种质子泵，它可水解由ATPase酶代谢产生的含有一个高能磷酸键的次级代谢物焦磷酸，同时将细胞质内的H⁺转运到液泡内形成跨液泡膜的质子梯度，为各种溶质(如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等)分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力(Blumwald E.1987.Physiologia Plantarum.69：731-734)。 

高等植物的第一个液泡膜H⁺-PPase基因AVP1(M81892)首先从拟南芥中克隆得到(Sarafian V，Kim Y，Poole R J，et al.1992.Natl.Acad.Sci.USA.89：1775 1779)。Gaxiola等(Gaxiola R A，Li J，Undurraga S，et al.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98：11444 11449)首次将带有35S启动子的AVP1基因转入拟南芥中，与野生型相比，发现AVP1蛋白含量显著增加的转基因植株幼苗在250mM NaCl中处理10天仍能正常生长发育，而野生植株型则出现黄化枯萎。Guo等(Guo S L，Yin H L，Zhang X，et al.2006.Plant Molecular Biology.60：41-50)将盐地碱蓬SsVP转入拟南芥，也发现超表达SsVP的转基因拟南芥细胞中积累包括Na⁺在内的更多阳离子，其抗旱性和耐盐性显著提高。Bao等(Bao A K，Wang S M，Wu G Q，et al.2009.Plant Science.176：232240)将拟南芥AVP1转入紫花苜蓿，与野生型相比，发现转基因紫花苜蓿的叶和根中积累了更多的Na⁺、K⁺和Ca2⁺，叶片具有更低的渗透势，其耐盐性和抗旱性也显著增强。这些研究结果表明：超表达液泡膜H⁺-PPase基因，的确可以促进转基因植株吸收大量的无机离子，尤其是把在细胞质中具有毒害效应的Na⁺区域化到液泡中作为有益的渗透调节剂，从而使植物在水分亏缺或盐分胁迫下表现出更强的抗旱性和耐盐性。 

此外，Li等(Li J，Yang H，Peer W A，et al.2005.Science.310：121125)发现，液泡膜H⁺-PPase还可控制生长素的运输、进而影响植物的生长发育，如超表达AVP1可提高生长素的运输效率，进而加快细胞的分裂和植物器官的形成及增生，从而提高生物量；相反，avp1-1缺失突变体由于生长素运输效率的降低，导致根和地上部发育受到严重抑制，从而大大减少了生物量。因此，转基因植株和野生型相比，具有更多的叶片和更发达的根系。发达的植物根系具有重要的生物学意义，可以从土壤中吸收更多的营养物质，因此具有发达根系的转基因植株具有显著增强的耐贫瘠能力。 

然而令人遗憾的是，目前已克隆的液泡膜H⁺-PPase基因多来自抗逆能力弱的模式植物或农作物，如拟南芥、小麦、水稻和烟草等(包爱科，张金林，郭正刚，等.2006.植物生理学通讯.42(4)：777-783)；而H⁺-PPase在荒漠旱生植物中尚未见报道。因此，更进一步地说，本发明动因就是：从一种荒漠旱生植物一霸王中优选了其泡膜H⁺-PPase基因并提供了它生产方法和用途。本发明提供了所选基因在获得抗旱耐盐转基因植物方面的应用，其为本发明的优选应用。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)液泡膜氢焦磷酸酶基因和植物表达载体及其植株遗传转化方法。本发明以霸王为材料，首次克隆出第一个荒漠旱生植物的液泡膜H⁺-PPase基因，并构建其植物表达载体以及含有该载体的工程农杆菌，可用于培育耐盐抗旱的农作物和优良牧草新品种(系)。 

本发明采取的技术方案为：一种强旱生植物霸王的液泡膜氢焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子，包含下属核酸分子：

(a).核酸编码链SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及其互补链； 

(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链； 

(c).(a)和(b)所述核酸分子的一部分。 

上述核酸分子序列可以是DNA、cDNA或RNA，且本领域的技术人员在知道SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3后，可以通过多种途径获得，如通过本发明所述的cDNA克隆、基因组重组、DNA合成、PCR技术或这些技术的组合。本发明的核酸分子并不受限于任何特殊途径的获得方式。更进一步地说，本发明提供的霸王的液泡膜H⁺-PPase基因ZxVP核酸分子还包括在严格条件下，可以与核酸分子核酸编码链SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及其互补链杂交的核酸分子及其互补序列，其中这些核酸分子编码具有液泡膜H⁺-PPase活性的蛋白。所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

本发明核酸分子编码的多肽蛋白，其包括序列表SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ I D NO：6中所示全部或部分氨基酸序列。本发明蛋白或蛋白片段可以很容易通过本领域技术人员所熟知的方法制备重组蛋白或天然蛋白。 

由所述的强旱生植物霸王的液泡膜氢焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子的编码蛋白所获得的单克隆抗体和多克隆抗体。 

本发明还涉及霸王的液泡膜氢焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子的生产和使用，尤其是利用该基因植物表达载体如pCAMBIA1302-ZxVP1-1产生耐盐抗旱高产的转基因植物的方法。 

含有所述核酸分子的载体，所述核酸分子包括：(a).核酸编码链SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及其互补链；(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c).(a)和(b)所述核酸分子的一部分。 

含有所述核酸分子的宿主菌，所述核酸分子包括：(a).核酸编码链SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及其互补链；(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c).(a)和(b)所述核酸分子的一部分。 

含有所述核酸分子的转基因细胞系或转基因植物及其后代，所述核酸分子包括：(a).核酸编码链SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及其互补链；(b).编码如(a)核酸分子所编码氨基酸的核酸分子以及其互补链；(c).(a)和(b)所述核酸分子的一部分。 

得到所述核酸分子在植物中超表达的遗传转化方法，其包括有： 

(a)克隆或合成权利要求1中的核酸分子； 

(b)将(a)步骤的核酸分子插入到可使其在转基因植物中超表达的载体中并将获得的表达载体转入根癌农杆菌，以获得转基因用工程农杆菌 

(c)通过(b)步骤的工程农杆菌将将本发明所述基因转入植物细胞或组织或种子； 

(d)将(c)步骤植物细胞或组织或者种子进行植株再生，其中转基因植株与野生型植株相比耐盐抗旱性提高或其它性状发生改良。 

附图说明： 

图1：霸王H⁺-Ppase基因ZxVP1-1的核酸序列及其预测的氨基酸序列。图左侧和右侧的数字分别代表核苷酸和氨基酸的位点，阴影部分ATG和TGA分别表示起始密码子和终止密码子，其它的阴影部分为H⁺-PPase的PPi结合位点。 

图2：霸王H⁺-PPase ZxVP1-1氨基酸序列的跨膜结构示意图。N和C分别代表霸王H⁺-PPase ZxVP1-1的氮末端和碳末端；圆柱上的编号代表跨膜区的个数，其中灰色圆柱代表确定的跨膜区，白色代表可能的跨膜区；L1(Loop length)代表连接两个跨膜区的多肽链上的氨基酸残基数目，KR代表该段肽链上所含有的精氨酸和赖氨酸残基的数目；CYTOPLASM代表细胞质一侧，EXTRACELLULAR代表细胞外或液泡内的一侧。 

图3：霸王H⁺-PPase ZxVP1-1与其它植物液泡膜H⁺-PPase氨基酸序列的多重比较。液泡膜H⁺-PPase的来源和基因库登录号分别为：拟南芥(Arabidopsis thaliana)AVP1：NM_101437；霸王(Zygophyllumxanthoxylum)ZxVP1-1：EU103624；水稻(Oryza sativa)OsVP：D45383；玉米(Zea mays)ZmVP：AJ715528；小盐芥(Thellungiella salsuginea)TsVP：AY436553；萄葡(Vitis vinifera)VvVP：AF257777。不同颜色背景分别表示氨基酸的不同保守性，其中黑色表示100％保守，灰色和白色分别表示≥50％和不足50％的同源性。 

图4：霸王H⁺-PPase酶ZxVP1-1与其它植物液泡膜H⁺-PPase酶氨基酸序列的系统进化树。液泡膜H⁺-PPase酶的来源和基因库登录号分别为：红叶藜(Chenopodium rubrum)CrVP1：AF533337；桃树(Prunus persica)PpVP：AF367447；盐穗木(Halostachys caspica)HcVP：EF471358；盐爪爪(Kalidiumfoliatum)KfVP：EF114315；番茄(Lycopersicon esculentum)LeVP：BT014617；烟草(Nicotiana rustica)NrVP：DQ630713；巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)HbVP：AY514019，其它的参考图3的图注。 

图5：霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1一价表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1的构建流程。 

图6：表达载体构建过程的电泳检测。其中：M：DNA Marker III；1：以霸王cDNA为模板的PCR扩增ZxVP1-1基因ORF框；2：PCR检测pMD19-T-ZxVP1-1载体；3：PCR检测pCAMBIA1302-ZxVP1-1。 

具体实施方式：

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

实施例1：霸王H⁺-PPase基因的克隆方法： 

根据其它植物H⁺-PPase基因的保守序列设计一对简并性引物，以霸王叶 片总RNA为模板，采用RT-PCR的方法扩增出H⁺-PPase基因片段并克隆到pUCm-T载体。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序，序列分析结果表明：克隆到3个同源的序列片段(898bp)，编码299个氨基酸；所得序列与GenBank中注册的高等植物H⁺-PPase基因核苷酸序列的同源性均在69％以上、氨基酸序列的同源性达78％以上。此外，三个片段都含有液泡膜H⁺-PPase所特有的PPi的结合位点和活性部位序列。高等植物中存在两种类型的H⁺-PPase：I型依赖K⁺激活而适度被Ca²⁺激活，主要分布在液泡膜上，II型对K⁺不敏感而对Ca²⁺极其敏感，主要分布在高尔基体和溶酶体上。这两种类型的H⁺-PPase酶亲缘关系较远，它们间的同源性仅有37-39％。本发明克隆到的三个片段与模式植物拟南芥I型H⁺-PPase AVP1的同源性分别为83.9％、94.6％和94.0％，而与II型H⁺-PPase AVP2的同源性仅为38.8％、39.1％和39.8％，由此表明，霸王的三个H⁺-PPase同源序列片段均属于I型。这些结果表明克隆到的三个片段均为H⁺-PPase基因片段。 

在此基础上，选择其中的一个片段作为模板，设计末端快速扩增(RACE)引物，获得该片段的3’端和5’端的序列。将克隆到的霸王液泡膜H⁺-PPase基因的核心片段、3’端和5’端的序列进行拼接，得到一个全长2695bp霸王液泡H⁺-PPase酶基因的cDNA(图1)。该eDNA包含一个2262bp开放阅读框(ORF)，编码753个氨基酸。起始密码子ATG前面有206bp长的5’非翻译区(5’-UTR)，终止密码子TGA后面有224bp包含poly(A)尾巴的3’非翻译区(3’-UTR)。本发明将该基因命名为ZxVP1-1(SEQ ID NO：1)，并在GenBank注册，登录号为EU103625；其编码的蛋白质命名为ZxVP1-1(SEQ IDNO：4)，注册号为ABU92563。此外，将另两个核心片分别命名ZxVP1-2(SEQI D NO：2)和ZxVP1-3(SEQ ID NO：3)，在GenBank中的登录号分别为EU103626和EU103627；其编码的蛋白质分别命名为ZxVP1-2(SEQ ID NO：5)和ZxVP1-3(SEQ ID NO：6)，注册号分别为ABU92564和ABU92565。 

霸王ZxVP1-1的cDNA编码一个由753个氨基酸残基构成的多肽蛋白，其分子量约为80KDa，等电点为6.27。疏水性分析表明，ZxVP1-1蛋白含有15个跨膜区(TM-transmebane)(图2)，其中在细胞质中的连接跨膜区TM5和TM6的环上含有液泡膜H⁺-PPase的PPi结合位点，序列为²⁰³GGG²⁰⁵、 ²¹²DVGADLVGK²²⁰和²³⁸KAADVGADLVGKVE²⁵⁰(图1)。这些序列基元(sequence motif)不但是H⁺-PPase实现质子转运功能所必需的(Hedlund J，Cantoni R，Baltscheffsky M，et al.2006.FEBS J.273：5183-5193)，而且还是高度保守的，与AVP1(NM_101437)、水稻OsVP(D45383)、小盐芥TsVP(AY436553)、葡萄VvVP(AF257777)和玉米ZmVP(AJ715528)的完全一致(图3)。将推测的ZxVP1-1与其他植物液泡膜H⁺-PPase的氨基酸序列进行比较发现：它与葡萄VvVP的同源性最高(85.5％)；其次是拟南芥AVP1，同源性为80.5％，接下来依次是TsVP(79.8％)，OsVP(79.7％)，ZmVP(78.7％)。在进化关系上，ZxVP1-1与木本植物葡萄VvVP关系较近，而与单子叶植物玉米ZmVP的关系较远(图4)。由此表明，本发明中的霸王H⁺-PPase ZxVP1-1基因应在液泡 膜上表达，并且具有其它植物液泡膜H⁺-PPase如拟南芥AVP1相同的功能。 

其具体的克隆方法如下： 

(1)总RNA的提取：采用《一种改进的多浆旱生植物霸王叶和根总RNA提取方法》(伍国强，席杰军，周向睿等.2008.分子植物育种.6(1)：1-4)一文所述方法提取总RNA。 

(2)cDNA第一条链的合成： 

①于冰上将7μl总重RNA，1μl Oligo(dT)₁₈(0.5μg/μl)和4μl ddH20按总体积12μl轻轻混匀，瞬时离心液体。 

②反应混合物在70℃水浴5分钟后，冰浴30秒，然后瞬时离心。 

③在冰上按顺序加入下列组分 

5×Reaction Buffer                 4μl 

RNase Inhibitor(20U/μl)           1μl 

dNTP Mix(10mmol/L)                 2μl 

④轻轻混匀后瞬时离心，37℃水浴5分钟，加入1μlM-MuLV RT(20U/μl)，终体积为20μl。 

⑤反应混合物37℃水浴60分钟(如果采用随机六合引物则预先在25℃温育10分钟，然后37℃水浴60分钟)。 

⑥在70℃加热10分钟结束反应，置冰上进行后续实验或-4℃冷冻保存。 

(3)PCR扩增： 

①在50μl PCR管中混合如下组分： 

Taq DNA Polymerase(5U/μl)        0.5μl 

10×PCR Buffer                    5μl 

2mmol/L dNTP                      5μl 

25mmol/L MgCl₂                    2.5μl 

Primer VPF(10μM)                 1μl 

Primer VPR(10μM)                 1μl 

cDNA                              4μl 

Sterilized ddH₂O                  31μl 

Total Volume                      50μl 

VPF：5’-TACTATGGTGATGA(T/C)TGGGAAGG-3’ 

VPR：5’-CAGCAAT(A/G)CC(A/T)CCAGCATT(A/G)TCAC-3’ 

②轻轻混匀并短暂离心将管壁上的液体收到管底，然后按下列条件进行反应： 

(4)基因克隆：取6μl PCR纯化产物与pUCm-T vector载体连接，操作步骤按上海生工“T-裁体PCR产物克隆试剂盒”说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5a，在表面涂有40μl X-gal(20mg/ml)、4μl IPTG(200mg/ml)的含有Amp(50μg/ml)的LB平板上37℃使之过夜培养。用牙签从转化平板上随机挑取白斑单菌落，在装有1ml LB+Amp(50μg/ml)的1.5ml离心管中37℃培养8-10小时。 

(5)质粒DNA的提取：碱裂解法提取质粒DNA。提取的质粒进行PCR鉴定，条件如3所述。 

(6)序列测序：将阳性克隆菌株送上海生工测序。测序结果表明，获得三个同源核心片段。 

(7)3’和5’序列的分离：按Invitrogen公司的TOPO TA 说明书操作。 

(8)将获得的霸王H⁺-PPase基因全长cDNA命名为ZxVP1-1，其余两个同源核心片段分别命名为ZxVP1-2和ZxVP1-3。 

实施例2：ZxVP的重组核酸分子载体 

根据不同的生产或实验目的，如获得重组蛋白或获得转基因植物，可以选择不同的载体和相应的宿主细胞以及相应的转化方法进行不同的实际应用。需要指出的是，本发明所述核酸分子并不限于某一个具体的表达载体，更不限于特定的转化宿主，同样也不限于特定的转化方法。 

含有本发明所述ZxVP任何核酸分子的全长或部分序列的任何重组核酸分子，该重组核酸分子可以在宿主细胞内表达或加强表达上述核酸分子所编码的多肽或多肽的一部分。所述重组核酸分子包括：各种类型的载体：如质粒、科斯质粒、噬菌体、杆状病毒、其它病毒等；适合在各种宿主细胞或生物体中表达的载体，这些细胞包括细菌、酵母、真菌、原虫、藻类、苔藓、裸子植物、种子植物、各种卵、各种动物等；适于植物细胞表达的载体，尤其指含有能加强所述核酸分子在宿主细胞内加强表达的诱导型或组成型启动子的载体，如本发明中实施例1中所述的克隆载体pUCm-T、实施例3中所述的鸡腺病毒表达载体AdCEV、实施例5中所述的大肠杆菌表达载体pGEX-2TK、实施例6中所述的克隆载体pMD19-T-ZxVP1-1、植物表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1。 

实施例3：霸王H⁺-PPase重组蛋白的获得 

获得霸王H⁺-PPase蛋白或该蛋白的一部分片段，可以采用“重组卵以及基于鸟类腺病毒的基因克隆和表达载体”(中国专利号：00815895.9)中所述的方法，将本发明所述核酸分子或核酸分子片段重组到一种鸡腺病毒表达载体AdCEV中，然后将这种重组核酸分子通过显微注射的方法转染至鸡卵中，再将这种转染的鸡卵在加湿培养箱中37℃下培养72小时后收集尿囊液并进行对重组H⁺-PPase蛋白或该蛋白的一部分进行分离纯化。纯化方法可以采用通常的纯化方法，如离子交换、亲和层析、免疫共沉淀等或这些方法的组合。当然，也可以采用适于在大肠杆菌或酵母中表达的载体来生产H⁺-PPase蛋白 或该蛋白的一部分片段。 

实施例4：霸王H⁺-PPase天然蛋白的获得 

天然蛋白的制备可以将本发明的载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1转化到霸王细胞(参考实施例7)，使转化细胞大量表达H⁺-PPase蛋白；然后用含有实施例5所述的单克隆或多克隆抗体的亲和层析柱从该细胞液泡膜微囊体的提取物中提取分离纯化天然的H⁺-PPase蛋白。液泡膜微囊体及其膜蛋白的提取方法参考Schumaker和Sze的方法(Schumaker，K.S.，and Sze，H.(1985).Plant Physiol 79，II I 1-1117)。 

实施例5：霸王H⁺-PPase酶的单克隆抗体和多克隆抗体的制备 

将本发明的核酸分子DNA插入适合于特定宿主的载体中，通过已知的基因转移方法如磷酸钙、电穿孔、氯化钙法等方法将上述载体转入细胞，如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞、爪蟾卵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等等，然后在适宜的培养条件下让转化细胞表达该重组蛋白。在宿主细胞中表达的重组蛋白可以用本技术领域人员熟知的方法进行纯化，如离子交换、亲和层析、液相色谱、二维凝胶电泳等方法。例如，把本发明的核酸分子或核酸分子片段亚克隆到载体pGEX-2TK(Pharmacia)使其在大肠杆菌(E.coli.)中超表达本发明多肽或多肽片段的GST融合蛋白。该融合蛋白可以用谷胱甘肽亲和层析方法纯化(分子克隆实验指南.第三版，科学出版社.1245-1248)。然后用作抗原在兔子体内制备多克隆抗体(精编分子生物学实验指南.第四版，科学出版社.492-496)。单克隆抗体可用上述纯化蛋白在鼠杂合细胞中制备(精编分子生物学实验指南.第四版，科学出版社.485-492)。 

实施例6：霸王H⁺-PPase基因表达载体的构建(图5) 

由于本发明核酸分子所编码产物在植物细胞代谢中具有重要的功能，如调节胞质和液泡的pH、清除各种代谢途径的副产物PPi、参与Na⁺、K⁺等溶质向液泡内运输，降低细胞的渗透势，进而提高细胞的耐盐抗旱性；此外，植物细胞中超表达该核酸分子还可促进生长素的运输效率，导致细胞加快分裂和增生，使植物根系更加茁壮和叶片更加繁茂，因而使植株可以耐贫瘠的土壤和增加生物量。所以，该核酸分子的一个重要实际应用就是用含有该核酸分子的植物表达载体改良当前具有重要意义的各种农作物或花草树木，使其相对非转基因植株来说具有更强的耐盐抗旱性或更高的产量。因此，本发明人根据已获得的霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1的序列设计了含酶切位点的引物，以霸王叶的总RNA为模板，采用RT-PCR方法，扩增出ZxVP1-1基因的ORF框，胶回收后连接到pMD19-TSimple Vector载体。测序确认正确后，将含有ZxVP1-1基因的ORF框的pMD19-T-ZxVP1-1载体酶切回收，并将回收到的产物正确无误地插入二元载体pCAMBIA1302以获得一价表达载体，并将其命名为pCAMBIA1302-ZxVP1-1。然后通过电击法获得了含有一价表达载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1的可用于对牧草或农作物进行遗传转化的工程根癌农杆菌GV3101。通过本工程农杆菌，可以获得耐盐抗旱高产的转基因植物。 

其具体的构建方法如下： 

(1)根据分离得到的霸王H⁺-PPase基因ZxVP1-1核苷酸序列设计引物：上游引物： 

5’-CCATGGTTGTGAAGATGGGTCAGGTGAAAGATAGCC-3’ 

下游引物： 

5’-GGTTACCGTGTATGTGTAGACTGTAGAGCAATGGC-3’。 

以叶的总RNA反转录成cDNA为模板，进行PCR反应，扩增该基因完整的开放阅读框框(ORF)。 

(2)取5μl PCR纯化产物与pMD19-T Simple Vector载体连接，操作步骤按大连宝生物公司“pMD19-T Simple Vector”说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5a，在表面涂有40μl X-gal(20mg/ml)、4μl IPTG(200mg/ml)的含有Amp(50μg/ml)的LB平板上37℃使之过夜培养。用牙签从转化平板上随机挑取白斑单菌落，在装有1ml LB+Amp(50μg/ml)的1.5ml离心管中37℃培养8-10小时。碱裂解法提取质粒DNA，进行序列测定。 

(3)用限制性内切酶NcoI和PspEI将霸王H⁺-PPa se基因ZxVP1-1ORF框从pMD19-T-ZxVP1-1载体上切下，与相同酶切的pCAMBIA1302二元表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培养基上选择培养，并对菌株进行PCR鉴定，然后送上海生工测序以确保连接正确。 

(4)将构建好的载体命名为pCAMBIA1302-ZxVP1-1，电转化到根癌农杆菌GV3101。电转化条件为：C＝25μF；PC＝200ohm；V＝2.4kV。 

在本实施例中，植物表达载体中与本发明所述核酸分子可操作连接的启动子是35SCaMV启动子。需要指出的是，本发明所述核酸分子可操作连接的启动子还可选自干旱诱导启动子、ABA诱导启动子、热激诱导启动子、盐诱导启动子、铜诱导启动子、类固醇诱导启动子和组织特异启动子等。 

实施例7：耐盐抗旱增产转基因作物的获得的方法 

以农杆菌介导的途径获得本发明的转基因百脉根： 

(1)无菌苗的获得：将籽粒饱满的百脉根种子洗净后用70％乙醇振荡消毒3-5分钟，0.1％升汞振荡灭菌1-2min，无菌水冲洗3-5次；在含无菌水的三角瓶中24℃黑暗吸胀过夜，之后接种于铺有无菌滤纸的培养皿中24℃暗培养1天，然后再接种至MS培养基上培养5-7天(光周期为16时/天，光照强度为200μmol/m2·s，温度为24℃)，即可获得无菌苗。 

(2)侵染菌液的制备：挑取鉴定好的根癌农杆菌GV3101加入含有50mg/LKan的YM液体培养基中，置28℃恒温摇床中，180rpm暗培养36小时至对数生长期(OD₆₀₀值为0.6-0.8)；4000rpm离心5分钟收集菌体，然后再加入适量的无菌B5液体培养基重悬浮工程菌，使达到最佳侵染浓度(OD₆₀₀＝0.5)。 

(3)浸染外植体的获得：将萌发5-7天的百脉根无菌苗的子叶(带叶柄)切成小块并接到分化培养基上(B5+0.5mg/L 6-BA)，黑暗条件下预培养3-4天。 

(4)侵染：将预培养的外植体放入制备好侵染菌液中，轻轻摇动，使外 植体与农杆菌充分接触20分钟。 

(5)共培养：将上述侵染过的外植体放在灭菌滤纸上吸干多余的菌液之后，接到分化培养基上(B5+0.5mg/L 6-BA)，在黑暗条件下共培养3天。 

(6)脱菌：将共培养后的外植体转移至含300mg/L Carb的分化培养基(B5+0.5mg/L 6-BA)上，24℃光照培养20天，中间继代一次。 

(7)抗性胚选择：将上述脱菌分化的外植体转移至含有10mg/L潮霉素(Hyp)的分化培养基中筛选2-3周，获得抗性芽点。 

(8)将抗性芽点移至生根培养基中使其生根，获得抗性转化植株。 

(9)对抗性植株进行RT-PCR检测，确保获得转基因苗。 

(10)对转基因植株进行生理生化分析，确保优良性状后，进行大田试验和新品种培育。

由于MS培养基、YM液体培养基、B5液体培养基和B5固体培养基的配方为本领域的技术人员所熟知，因此不再赘述。至于分化培养基和生根培养基，其分别是0.5mg/L 6-BA的B5固体培养基和0.05mg/L NAA的1/2MS固体培养基。 

本发明所述植物表达载体载体pCAMBIA1302-ZxVP1-1适合在所有植物细胞中表达。因此，本发明的基因并不限制植物的类型，它们可以是单子叶植物、双子叶植物；可以是种子植物、裸子植物；也可以是苔藓类、蕨类、藻类和高等植物；也可以是经济作物、粮食作物、牧草、花草树木等。本发明优选比较重要的植物有马铃薯、番茄、芸薹、棉花、向日葵、草莓、菠菜、莴苣、水稻、大豆、水稻、棉花、玉米、小麦、黑麦草、大麦、滨藜、碱篷、燕麦、大麦、啤酒花、甘蔗、苜蓿、百脉根、羊茅、高羊茅、早熟禾、三叶草、箭舌豌豆、向日葵、甜菜、胡椒、烟草、西瓜、西葫芦、豌豆、可可、大麻、咖啡、葡萄、漆树、桦树、松树、橡树、杨树、康乃馨、玫瑰、花生、油菜、甜菜、柳枝稷、木薯和藻类等。此外，可以根据不同的植物和相应的载体类型使用不同的转化方法，如农杆菌介导、基因枪、显微注射、电穿孔、聚乙二醇、磷酸钙共沉淀等方法获得本发明基因的转基因植株。 

实施例8：得到所述的核酸分子在植物中超表达的遗传转化方法，步骤包括： 

(1)克隆或合成本发明所述的核酸分子，按实施例1的步骤； 

(2)将(1)步骤的核酸分子插入到可使其在转基因植物中超表达的载体中然后将表达载体转入根癌农杆菌，以获得转基因用工程农杆菌，按实施例6的步骤； 

(3)通过(2)步骤的工程农杆菌将本发明所述的核酸分子转入植物细胞或组织或种子，按实施例7的步骤； 

(4)将(3)步骤植物细胞或组织或者种子进行植株再生，其中转基因植株与野生型植株相比耐盐抗旱性提高或其它性状发生改良。 

实施例9：霸王H⁺-PPase突变体研究工具 

根据霸王H⁺-PPase ZxVP1-1和其它物种H⁺-PPase的氨基酸序列的同源 比对找出保守氨基酸残基，然后参考ZxVP1-1的跨膜预测模型，找出一些重要区段中的靠近或在α-螺旋跨膜内部的特异氨基酸残基，利用定点突变技术将ZxVP1-1cDNA中相应密码子突变并将其构建到含有酵母启动子GAL1的pYES2载体中(Invitrogen)。将这些载体分别转化到酵母中进行异源表达分析。分离酵母微囊体并对微囊体上的霸王H⁺-PPase突变体利用上述抗体进行酶联免疫定量，然后通过测定该微囊体焦磷酸依赖的质子转运活性来确定霸王H⁺-PPase突变体的活性。研究人员也可以根据专业背景在ZxVP1-1cDNA中插入特定的密码子后分析其翻译产物的活性。本领域的技术人员可以将具有活性提高的H⁺-PPase酶突变体的DNA构建成植物表达载体。 

实施例10：从其它多浆旱生植物中鉴定同源核酸分子 

可根据本发明所公布的核酸序列和其他植物H⁺-PPase基因的核苷酸序列进行同源性的比较，找出高度保守的区段；再根据同源性高和简并性低的原则，利用DNAMAN和Primer 5.0引物设计软件设计上下游简并性引物；提取目标植物的总RNA并反转录成cDNA作为PCR模板以扩增目标植物的H⁺-PPase基因的片段。然后再根据所得基因片段为根据，设计3’RACE和5’RACE引物，分离3’和5’序列的序列。然后进行3’序列、5’序列和核心序列的拼接即可得到全长cDNA(参考实施例1)。 

此外，熟知本领域的技术人员也可以用霸王H⁺-PPase基因全长cDNA作为探针从目标植物的cDNA文库或基因组文库中以较低的严谨度筛选出目标植物的H⁺-PPase基因。 

实施例11：霸王H⁺-PPase基因作为RNA干扰的设计工具 

每种生物在漫长的进化过程中都形成了对环境的独特适应机制。这种独特适应机制的实现得益于其独特遗传物质在时空上能够精准有序地转录、翻译和翻译产物定位。本发明获得的霸王H⁺-PPase基因三个同源核心片段说明霸王至少具有三个不同的液泡膜氢焦磷酸酶。然而，每种氢焦磷酸酶在霸王细胞内的亚细胞器上的精细定位以及各自对霸王的独特适应机制的贡献究竟如何，目前尚不清楚。因此，研究人员可以根据本发明的核酸序列设计RNA干扰序列，对霸王的不同氢焦磷酸酶基因进行干扰，然后测定各种干扰后的霸王生理生化指标的变化，以确定各种氢焦磷酸酶在霸王抗性的具体作用。 

实施例12：生态恢复与环境保护 

目前全球有大面积植物难以生长的地区。这些地区生态环境恶劣，气候干旱、土壤贫瘠，或伴有不同程度的盐渍化。基于此，可以将本发明的基因转化到适宜的地方植物中，然后将耐盐抗旱耐贫瘠的转基因植物在这些地区种植，一方面可以在一定程度上恢复当地的植被盖度，防止荒漠化继续扩大；另一方面可以改良土壤，如增加土壤有机质，疏松土壤结构，增加土壤微生物活性和多样性等。 

由于温室气体引起的全球气候变化给人类的发展带来了很多不确定的因素，如海平面的大幅上升，气候的变迁、极端气候的频发等，因此CO₂的减排问题成为各国政府、科学界和民众的关注焦点。在这一背景下，碳税产 业也迅猛发展。因此，有些高排放量的企业可在干旱、盐渍、贫瘠的土地上大量种植具有本发明的耐受性的转基因植物，以固定空气中的CO₂，将在防止全球气候变暖方面具有积极重要的意义。 

上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>兰州大学

<120>强旱生植物霸王液泡膜氢焦磷酸酶基因和植物表达载体及其植株遗

     传转化方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2695

<212>DNA

<213>霸王

<400>1

aactaacaaa gcaatacatg gctaccattg actttaaaga acatactgat taaccagttt     60

cacaaaactc aaaacactac cttgaacaca taaaccaact tgtcgtccaa aaagtttaaa    120

gatttcagta tctatacaaa aaagatcctg cttagatata ttttctatag tctatacagt    180

ttcagaggtt cttgggggtt gtgaagatgg gtcaggtgaa agatagcctt actcagagtc    240

taatacctat tgctgctttt gtgggaattg gttttgcttt gtttcagtgg tacttggtgt    300

ccagggtgaa agtgtcaaga aggtataata ccaggttgat gagtcatgaa gaagacggcg    360

ttgataatgc tgatgttgag tacaagtgtg cagaaattca gaatgctatt tctgttgggg    420

cgacatcgtt tctctacact cagtataaat acctcggcat cttcacagga cttttcagtc    480

tagtaatatt tttcttccta ggttcagtaa ataaattcag caccaaaagc cagccttgtg    540

tttataacac tggacaactc tgtaaaccag ccctggcaaa tgctatcttt actaccattg    600

ctttcctgtt aggtgctctg acttctgtgc tctctggttt tctcggcatg aaaattgcaa    660

cctatgccaa tgctagaaca actttagaag cacggaaaag tgttggaaag gcatttagta    720

cagcttttcg gtctggagct gttatgggtt tccttctggc tgccaatggc ctttttgtgc     780

tttatgtctc catcaattta ttcagacttt attatggaga tgattgggaa ggactttatg     840

aatctatcac tggctatggt cttgggggtt cttcaatggc tttgtttgga agagtcggag     900

gagggattta caccaaggct gcggatgttg gtgctgacct tgttgggaaa gttgaacaaa     960

atatcccaga agatgatcca cgaaaccctg ctgttattgc agataacgtg ggcgacaatg    1020

taggagacat tgctgggatg ggttccgact tgtttggttc ttatgctgaa tcatcttgtg    1080

cagcactttt cgtagcatcc atttcatcct tcggtatcaa tgatgactat gccgccatgt    1140

cttatcctct tatgataagt tcaatgggga ttattgtttg cttagtgacg actctatttg    1200

caactgattt ttttgagatt aaggaagtcc gtcaaatcga accatccctg aagcgtcagc    1260

ttcttatctc aacaatattg atgactgttg ggatttctat agttggttat atcagcttac    1320

ctgcagagtt cactcttttc aactttgggc atctaaaagt tgtaagaaga tggcaactct    1380

tcttctgcgt gtctattggg ctgtgggctg gacttgctat tggatatact acagaatatt    1440

acacaagcaa tgcttatagt ccagtgcgag atgtggccga ctcttgcaga actggtgctg    1500

ctacaaatgt aatttttggg ctggctctgg gatataaatc tgtgataatt cccatatttg    1560

ctatagctgc tgctatatat gtgagcttca gactggccgc tatctatggt attgctatgg    1620

ctgcactggg aatgctcagc actattgcta caggtcttgc cattgatgct tatggcccca    1680

taagtgataa tgcaggcggt attgcagaaa tggccggaat gagccacgaa gtacgagaaa    1740

gaacagatgc tttagatgct gctggaaata ctacggctgc cattgggaag ggatttgcta    1800

ttggatcagc cgcccttgtt tctcttgctt tgtttggtgc ctttgttgga agggctggaa    1860

tcgaatttgt ggatgtgatg agtcctgagg ttttcattgg gttacttgtt ggtgctatgc    1920

ttccatactg gttttctgcc atgacaatga agagtgtagg aagtgcagct cttaaaatgg    1980

tagaggaggt ccgtcggcag ttcaggacta ttcctggcct catggaagga agagtcaaac    2040

cagattatgc aacttgtgtc aaaatctcta ctgacgcttc actcaaagaa atgattgcac    2100

ctggtgcttt agtcatgttt acaccactta tagttggaac cttcttcggg gtggaaaccc    2160

tcgctggagt actggcaggt tcgcttgttt ctggtgtgca ggttgccatc tcagcgtcca    2220

acacaggtgg ggcgtgggat aatgcaaaga aatatatcga ggctggtgcc tctcaacatg    2280

ctaaatcact gggtcctaaa gggtcagatg cacataaggc tgcagtaatt ggcgatactg    2340

tcggagatcc gctcaaggac acttccggtc catcccttaa tatcctcatc aagctgatgg    2400

cagtggagtc attggtattc gctccatttt ttgcagctca tggaggatta attttcaaga    2460

atatatagat cagggccatt gctctacagt ctacacatac acttagtaga gacgttgtta    2520

tgggaggatc cattgtaatc agtagttagc cactagaagg aagttttaac atgccgtctt    2580

ccgatcaaat atttgcgaat ttcatcgtta ataagcacag gaactgagta tgtaaattgt    2640

tatcttattc ttcaggcaaa atggtgtgtt tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa         2695

 

<210>2

<211>898

<212>DNA

<213>霸王

<400>2

tactatggtg atgattggga aggccttttc gaggcaatta ctggttatgg tcttggagga    60

tcttcgatgg ctctttttgg aagagttggt ggaggcatct acacaaaggc tgcagatgtt    120

ggtgctgatc ttgtgggaaa ggtggaaaga aacatcccag aagatgatcc aagaaaccca    180

gctgtgattg cagacaatgt tggtgataat gtcggggata ttgctggaat ggggtctgat    240

ctttttggct cttatgcaga atcatcttgt gctgctcttg ttgtggcttc aatttcctcc    300

tttgggatta accatgattt cactgccatg tgttatcctt tgctcatcag ttccatggga    360

atccttgttt gtctgattac aactcttttt gccactgatt tctttgaaat taagggtgtc    420

aaagatatag aaccgacatt gaaaagacag cttatcattt ccacagttct gatgaccctg    480

ggtattgcaa ttgttagctg ggtcgccctg ccaccatcgt ttacaatatt caattttggt    540

gttcagaaag aagtgaagaa ctggcaacta tttttgtgcg tgggtgttgg tctctgggct    600

gggctcatta ttgggtttgt aactgagtac tataccagca atgcctacag tcctgtgcaa    660

gatgtggcgg actcctgcaa gactggagct gcaacaaatg ttatctttgg gcttgctttg    720

ggatacaagt ctgtcatcat ccccattttc gctattgctg tcagcatttt tgttagcttc    780

agctttgcag ctatgtatgg aattgcagtg gctgcccttg gaatgttgag caccattgct    840

actggattag caattgatgc atatggaccc attagtgaca atgctggtgg cattgctg      898

 

<210>3

<211>898

<212>DNA

<213>霸王

<400>3

tactatggtg atgattggga aggccttttc gaggcaatta ctggttatgg tcttggagga      60

tcttcgatgg ctctttttgg aagagttggt ggaggcatct acacaaaggc tgcagatgtt    120

ggtgctgacc ttgtggggaa ggtggaaaga aatatcccag aagatgatcc aagaaaccct    180

gctgttattg cagacaatgt tggtgataat gttggagata tagccggtat ggggtctgat    240

ctgtttggat catatgctga atcatcttgt gctgccctgg ttgtcgcttc tatctcctcc    300

tttggaatta accatgactt tactgccatg tgttatcctc ttctcatcag ttccatgggg    360

attcttgttt gtttgatcac aactctcttt gccactgata tctttgagat taaggctgtc    420

aaggagatag aaccggcatt aaaaaggcag cttatcattt ccactgttct tatgactatt    480

ggaattgcaa ttattagttg gattgccctg ccgtcatctt tcacaatatt caatttcggt    540

gaacagaaag ttgtgaagag ctggcaacta ttcttgtgtg tggctatagg tctttgggct    600

gggctcatca ttggttttgt taccgagtac tacaccagca atgcttatag ccctgtgcaa    660

gatgtagctg attcctgcag aactggagct gctaccaatg tcatttttgg ccttgctttg    720

ggatacaaat ctgtcatcat cccaatattt gccattgcgg ttagcatctt tgtgagcttc    780

acttttgctg ccatgtatgg tattgctgtg gctgcccttg gaatgttgag cacaattgcg    840

actggattgg caattgatgc atatggtccc attagtgaca atgctggtgg tattgctg      898

 

<210>4

<211>753

<212>PRT

<213>霸王

<400>4

Met Gly Gln Val Lys Asp Ser Leu Thr Gln Ser Leu Ile Pro Ile Ala

1                5                      10                      15

Ala Phe Val Gly Ile Gly Phe Ala Leu Phe Gln Trp Tyr Leu Val Ser

             20                      25                   30

Arg Val Lys Val Ser Arg Arg Tyr Asn Thr Arg Leu Met Ser His Glu

         35                     40                   45

Glu Asp Gly Val Asp Asn Ala Asp Val Glu Tyr Lys Cys Ala Glu Ile

    50                    55                     60

Gln Asn Ala Ile Ser Val Gly Ala Thr Ser Phe Leu Tyr Thr Gln Tyr

65                      70                    75                   80

Lys Tyr Leu Gly Ile Phe Thr Gly Leu Phe Ser Leu Val Ile Phe Phe

                  85                    90                     95

Phe Leu Gly Ser Val Asn Lys Phe Ser Thr Lys Ser Gln Pro Cys Val

             100                    105                   110

Tyr Asn Thr Gly Gln Leu Cys Lys Pro Ala Leu Ala Asn Ala Ile Phe

        115                   120                    125

Thr Thr Ile Ala Phe Leu Leu Gly Ala Leu Thr Ser Val Leu Ser Gly

    130                    135                   140

Phe Leu Gly Met Lys Ile Ala Thr Tyr Ala Asn Ala Arg Thr Thr Leu

145                   150                    155                  160

Glu Ala Arg Lys Ser Val Gly Lys Ala Phe Ser Thr Ala Phe Arg Ser

                  165                    170                   175

Gly Ala Val Met Gly Phe Leu Leu Ala Ala Asn Gly Leu Phe Val Leu

             180                    185                  190

Tyr Val Ser Ile Asn Leu Phe Arg Leu Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu

         195                    200                   205

Gly Leu Tyr Glu Ser Ile Thr Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met

    210                     215                  220

Ala Leu Phe Gly Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp

225                   230                    235                   240

Val Gly Ala Asp Leu Val Gly Lys Val Glu Gln Asn Ile Pro Glu Asp

                  245                   250                    255

Asp Pro Arg Asn Pro Ala Val Ile Ala Asp Asn Val Gly Asp Asn Val

            260                     265                    270

Gly Asp Ile Ala Gly Met Gly Ser Asp Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu

         275                    280                   285

Ser Ser Cys Ala Ala Leu Phe Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile

    290                    295                      300

Asn Asp Asp Tyr Ala Ala Met Ser Tyr Pro Leu Met Ile Ser Ser Met

305                   310                   315                    320

Gly Ile Ile Val Cys Leu Val Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asp Phe Phe

                    325                  330                   335

Glu Ile Lys Glu Val Arg Gln Ile Glu Pro Ser Leu Lys Arg Gln Leu

              340                    345                    350

Leu Ile Ser Thr Ile Leu Met Thr Val Gly Ile Ser Ile Val Gly Tyr

         355                    360                      365

Ile Ser Leu Pro Ala Glu Phe Thr Leu Phe Asn Phe Gly His Leu Lys

     370                    375                  380

Val Val Arg Arg Trp Gln Leu Phe Phe Cys Val Ser Ile Gly Leu Trp

385                   390                   395                    400

Ala Gly Leu Ala Ile Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala

                  405                   410                    415

Tyr Ser Pro Val Arg Asp Val Ala Asp Ser Cys Arg Thr Gly Ala Ala

             420                    425                    430

Thr Asn Val Ile Phe Gly Leu Ala Leu Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile

        435                     440                    445

Pro Ile Phe Ala Ile Ala Ala Ala Ile Tyr Val Ser Phe Arg Leu Ala

    450                      455                     460

Ala Ile Tyr Gly Ile Ala Met Ala Ala Leu Gly Met Leu Ser Thr Ile

465                     470                   475                    480

Ala Thr Gly Leu Ala Ile Asp Ala Tyr Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala

                 485                     490                    495

Gly Gly Ile Ala Glu Met Ala Gly Met Ser His Glu Val Arg Glu Arg

             500                    505                   510

Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ala Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ile Gly Lys

        515                    520                    525

Gly Phe Ala Ile Gly Ser Ala Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu Phe Gly

    530                     535                    540

Ala Phe Val Gly Arg Ala Gly Ile Glu Phe Val Asp Val Met Ser Pro

545                   550                     555                    560

Glu Val Phe Ile Gly Leu Leu Val Gly Ala Met Leu Pro Tyr Trp Phe

                   565                  570                   575

Ser Ala Met Thr Met Lys Ser Val Gly Ser Ala Ala Leu Lys Met Val

            580                     585                   590

Glu Glu Val Arg Arg Gln Phe Arg Thr Ile Pro Gly Leu Met Glu Gly

        595                     600                 605

Arg Val Lys Pro Asp Tyr Ala Thr Cys Val Lys Ile Ser Thr Asp Ala

    610                    615                    620

Ser Leu Lys Glu Met Ile Ala Pro Gly Ala Leu Val Met Phe Thr Pro

625                   630                    635                    640

Leu Ile Val Gly Thr Phe Phe Gly Val Glu Thr Leu Ala Gly Val Leu

                  645                   650                    655

Ala Gly Ser Leu Val Ser Gly Val Gln Val Ala Ile Ser Ala Ser Asn

             660                    665                      670

Thr Gly Gly Ala Trp Asp Asn Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Ala Gly Ala

        675                    680                     685

Ser Gln His Ala Lys Ser Leu Gly Pro Lys Gly Ser Asp Ala His Lys

    690                     695                   700

Ala Ala Val Ile Gly Asp Thr Val Gly Asp Pro Leu Lys Asp Thr Ser

705                     710                  715                   720

Gly Pro Ser Leu Asn Ile Leu Ile Lys Leu Met Ala Val Glu Ser Leu

                 725                    730                    735

Val Phe Ala Pro Phe Phe Ala Ala His Gly Gly Leu Ile Phe Lys Asn

             740                    745                     750

Ile

 

<210>5

<211>299

<212>PRT

<213>霸王

<400>5

Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu Gly Leu Phe Glu Ala Ile Thr Gly Tyr

1                     5                 10                    15

Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met Ala Leu Phe Gly Arg Val Gly Gly Gly

             20                     25                    30

Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp Val Gly Ala Asp Leu Val Gly Lys Val

         35                      40                     45

Glu Arg Asn Ile Pro Glu Asp Asp Pro Arg Asn Pro Ala Val Ile Ala

    50                     55                    60

Asp Asn Val Gly Asp Asn Val Gly Asp Ile Ala Gly Met Gly Ser Asp

65                    70                      75                    80

Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Ser Cys Ala Ala Leu Val Val Ala

                 85                      90                     95

Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile Asn His Asp Phe Thr Ala Met Cys Tyr

               100                    105                   110

Pro Leu Leu Ile Ser Ser Met Gly Ile Leu Val Cys Leu Ile Thr Thr

        115                     120                     125

Leu Phe Ala Thr Asp Phe Phe Glu Ile Lys Gly Val Lys Asp Ile Glu

    130                   135                    140

Pro Thr Leu Lys Arg Gln Leu Ile Ile Ser Thr Val Leu Met Thr Leu

145                  150                     155                    160

Gly Ile Ala Ile Val Ser Trp Val Ala Leu Pro Pro Ser Phe Thr Ile

                    165                    170                  175

Phe Asn Phe Gly Val Gln Lys Glu Val Lys Asn Trp Gln Leu Phe Leu

            180                     185                  190

Cys Val Gly Val Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ile Ile Gly Phe Val Thr

        195                     200                    205

Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala Tyr Ser Pro Val Gln Asp Val Ala Asp

    210                    215                    220

Ser Cys Lys Thr Gly Ala Ala Thr Asn Val Ile Phe Gly Leu Ala Leu

225                   230                    235                     240

Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ile Ala Val Ser Ile

                  245                       250                  255

Phe Val Ser Phe Ser Phe Ala Ala Met Tyr Gly Ile Ala Val Ala Ala

             260                    265                     270

Leu Gly Met Leu Ser Thr Ile Ala Thr Gly Leu Ala Ile Asp Ala Tyr

        275                     280                   285

Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala Gly Gly Ile Ala

    290                     295

 

<210>6

<211>299

<212>PRT

<213>霸王

<400>6

Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu Gly Leu Phe Glu Ala Ile Thr Gly Tyr

1                 5                    10                     15

Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met Ala Leu Phe Gly Arg Val Gly Gly Gly

             20                    25                    30

Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp Val Gly Ala Asp Leu Val Gly Lys Val

         35                      40                     45

Glu Arg Asn Ile Pro Glu Asp Asp Pro Arg Asn Pro Ala Val Ile Ala

    50                     55                    60

Asp Asn Val Gly Asp Asn Val Gly Asp Ile Ala Gly Met Gly Ser Asp

65                   70                      75                     80

Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Ser Cys Ala Ala Leu Val Val Ala

                 85                      90                    95

Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile Asn His Asp Phe Thr Ala Met Cys Tyr

              100                     105                   110

Pro Leu Leu Ile Ser Ser Met Gly Ile Leu Val Cys Leu Ile Thr Thr

        115                     120                     125

Leu Phe Ala Thr Asp Ile Phe Glu Ile Lys Ala Val Lys Glu Ile Glu

    130                    135                    140

Pro Ala Leu Lys Arg Gln Leu Ile Ile Ser Thr Val Leu Met Thr Ile

145                   150                     155                  160

Gly Ile Ala Ile Ile Ser Trp Ile Ala Leu Pro Ser Ser Phe Thr Ile

                    165                     170                175

Phe Asn Phe Gly Glu Gln Lys Val Val Lys Ser Trp Gln Leu Phe Leu

            180                     185                   190

Cys Val Ala Ile Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ile Ile Gly Phe Val Thr

         195                    200                     205

Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala Tyr Ser Pro Val Gln Asp Val Ala Asp

    210                    215                    220

Ser Cys Arg Thr Gly Ala Ala Thr Asn Val Ile Phe Gly Leu Ala Leu

225                   230                    235                   240

Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ile Ala Val Ser Ile

                  245                       250                  255

Phe Val Ser Phe Thr Phe Ala Ala Met Tyr Gly Ile Ala Val Ala Ala

             260                    265                     270

Leu Gly Met Leu Ser Thr Ile Ala Thr Gly Leu Ala Ile Asp Ala Tyr

        275                     280                   285

Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala Gly Gly Ile Ala

    290                     295