拟南芥种子发育过程中SHB1基因的表达与功能分析

摘要

种子是人类粮食的重要来源，有些植物的种子还是重要的工业原料，与人类的生产生活密不可分。因此，通过遗传学和分子学手段提高种子产量具有重要的现实意义。种子大小是影响产量的主要因素之一，以拟南芥作为模式植物，研究调控种子大小的分子机理和寻找控制种子大小的基因，不仅具有重要的理论价值，而且还可将其应用于实践，对提高种子产量起着至关重要的作用。拟南芥功能获得突变体shb1-D的种子明显较野生型的大，功能缺失突变体shb1-L的种子稍微比野生型的小。本实验通过对这两种突变体在控制种子大小方面的研究，初步得出了如下结果和结论： 1.shb1-D突变体胚的细胞面积和细胞数目增加对成熟胚细胞大小及细胞数目的分析结果显示，与Wassilewskija(Ws)野生型相比，shb1-D突变体胚的细胞面积和细胞数目都增加；shb1-L缺失突变体胚的细胞面积与细胞数目与Columbia(Col)野生型相比，略有变小。 2.shb1-D突变体种子的发育时期延迟对授粉后同一时间突变体与野生型种子的发育时期进行了对比分析，研究发现shb1-D突变体胚的发育较Ws野生型延迟；shb1-L突变体胚的发育时期与Col野生型基本一致。 3.SHB1基因在多种器官中表达GUS报告基因在SHB1启动子驱动下的表达结果显示，在拟南芥的花、成熟花粉粒、花粉管、小苗及未授粉胚珠中具有GUS信号积累，证明SHB1基因在拟南芥植株的多种器官中表达。mRNA原位杂交结果显示该基因在不同发育时期的胚和胚乳中表达，表明SHB1基因在种子发育过程中可能起重要的调控作用。 4.shb1-D突变体胚乳的细胞化延迟对授粉后5天以及胚发育处于相同时期的shb1-D突变体和Ws野生型种子进行组织切片分析，结果表明这两种条件下，野生型种子的胚乳已经开始细胞化，而突变体种子的胚乳依然没有细胞化，推测可能是突变体胚乳细胞化的延迟导致了种子体积的变大。 以上结果表明SHB1基因参与了对拟南芥种子大小的控制。在shb1-D功能获得突变体中，SHB1基因过量表达，使得种子变大。该研究发现了一个对种子大小有正调控作用的基因，为深入研究种子大小决定的机理提供了重要资料。

目录

论文说明:英文缩略表

声明

摘要

1引言

1.1被子植物种子的发育

1.1.1被子植物胚的发育

1.1.2被子植物胚乳的发育

1.1.3被子植物种皮的发育

1.2影响种子发育的因素

1.2.1影响胚发育的因素

1.2.2影响胚乳发育的因素

1.2.3无融合生殖与种子发育

1.2.4基因组印迹与种子发育

1.3控制种子大小的遗传机制

1.3.1IKU途径对种子大小的控制

1.3.2 TTG2途径对种子大小的控制

1.3.3 IKU途径和TTG2途径互作控制种子的大小

1.3.4 AP2途径对种子大小的控制

1.3.5控制种子大小的模型

1.4细胞数目和细胞大小决定种子的大小

1.5 SHB1基因

1.5.1 SHB1基因的克隆

1.5.2SHB1基因的定位与已知功能

1.6本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶及生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1植物基因组DNA的提取

2.2.2植物组织总RNA的提取及检测

2.2.3反转录cDNA第一链的合成

2.2.4 PCR扩增

2.2.5连接反应

2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.7碱法小量质粒DNA的提取

2.2.8质粒DNA的酶切鉴定

2.2.9 DNA序列测定

2.2.10目的片段的回收

2.2.11根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化

2.2.12pSHB1∷GUS表达载体的构建

2.2.13拟南芥的栽培、转化及分析

2.2.14微分干涉差显微照相分析

2.2.15原位杂交

2.2.16 GUS染色分析

2.2.17花粉粒体外萌发实验

2.2.18半薄切片的制作

3结果与分析

3.1 shb1-D与shb1-L突变体种子的表型分析

3.2突变体成熟胚细胞大小与细胞数目的分析

3.2.1 shb1-D成熟胚细胞大小与细胞数目的分析

3.2.2 shb1-L成熟胚细胞大小与细胞数目的分析

3.3突变体种子发育进程的分析

3.3.1 shb1-D突变体种子的发育时期延迟

3.3.2 shb1-L突变体种子发育时期与野生型基本一致

3.4 SHB1基因在不同器官中的表达分析

3.5 SHB1基因在种子中的时空表达分析

3.6 shb1-D突变体胚乳的细胞化延迟

3.6.1授粉后shb1-D突变体胚乳的细胞化延迟

3.6.2胚发育shb1-D突变体胚乳的细胞化延迟

4讨论

4.1 SHBl基因促进细胞的分裂与扩张

4.2 shb1-L功能缺失突变体表型不明显可能与存在同源基因有关

4.3 SHB1基因过量表达使种子的发育时间延长

4.4 SHB1基因在拟南芥植株的多种器官中表达

4.5胚乳细胞化延迟使shb1-D突变体种子变大

4.6 SHB1基因通过IKU途径参与对种子大小的调控

5结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢