奶山羊胎盘肽的分离提纯及其对小白鼠免疫功能的影响

摘要

自1985年，刘月新首次采用“匀浆一透析法”提取胎盘肽以来，广大科研工作者对胎盘肽进行了大量的理化分析与生物活性测定的研究，发现其在临床用于治疗病毒性肝炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等，有较为理想的疗效。奶山羊胎盘的结构和功能与人的胎盘有许多相似之处，近几年来已有报道，从羊的胎盘中也可以提取出羊胎盘肽并且具有与人胎盘肽类似的生物学活性。但是对奶山羊胎盘肽的研究还没有，测定其理化性质和生物活性，看其与人胎盘肽的活性是否一致。可以为奶山羊胎盘肽的研究和将其用于治疗动物或人疾病方面提供一定的依据。以前的报道多集中于经透析或超滤制的的混合小肽的活性的研究。本试验将经过超滤和superdex75层析对混合小肽进行分离，通过检测各个组分的生物学活性来筛选有活性的组分，为下一步的生物合成或化学合成提供一定的依据。整个研究包括两大部分： 一、奶山羊胎盘肽的分离提纯和含量测定 将冷冻的奶山羊胎盘常温解冻，洗净血液后用生理盐水冲洗胎盘，取胎盘的子叶，将子叶剪碎，经过反复冻融，经高速组织捣碎匀浆机匀浆，高速冷冻离心机离心沉淀，取上清液分别用0.45μm、0.22μm的滤器进行微滤，以除去不溶物质；微滤液经MilloporYM-10型超过滤器过滤得到粗样品，粗样品是无色透明液体，具有可透析性，可超滤性，无热原的小分子多肽，pH值为6.6～6.9；粗样品经superdex75层析得到四个组分肽类，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，冷冻干燥后均为白色的粉末；四组分经加脲和甘油Tricine-SDS-PAGE.电泳法电泳。结果显示组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的分子量分别为10.139KDa、8.166KDa、7.447KDa和6.761KDa；由考马斯亮蓝G-250法测定组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量分别为：0.96mg/g、1.2mg/g、1-32mg/g、1.8mg/g。 二、奶山羊胎盘肽对小白鼠免疫功能的影响 本实验将小白鼠随机分为6大组，其中5组为实验组(分别腹腔注射组分：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和粗提物)：每个实验组又分为高中低三种剂量小组(分别为0.1mL，、0.2mL、0.4mL)，每小组5只；对照组5只，仅注射生理盐水。每天注射一次，连续注射一周。通过对小鼠外周血血清白介素2含量、脾脏T淋巴细胞增殖反应、僻脏NK细胞活性和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响来考察奶山羊胎盘肽的免疫活性作用。 1.通过放射性免疫法测定小鼠外周血中IL-2的含量，结果显示，组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以显著提高小鼠外周血中IL-2的含量，比对照组提高了15.3％～30.1％(p＜0.05)。 2.通过MTT法测定脾脏T淋巴细胞增殖反应，结果显示，组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以在体内能极显著协同ConA刺激脾脏淋巴细胞增殖(p＜0.01)。 3.通过MTT法测定脾脏NK细胞的杀伤活性，结果显示，组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以极显著提高小白鼠脾脏NK细胞的杀伤活性(p＜0.01)。 4.通过腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验可知，组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以极显著提高小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能(p＜0.01)。 由以上奶山羊胎盘肽对小鼠免疫功能影响的4个实验结果中，发现存在剂量关系，随着浓度的能加而增强，但是差异不显著；在奶山羊胎盘肽中有免疫活性的是组分Ⅲ和Ⅳ。

目录

文摘

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引言

1.胎盘肽生物学功能的研究进展

1.1胎盘肽的概念及其理化性质

1.2抗病毒性肝炎

1.3护肝作用

1.4抗结核作用

1.5抗免疫抑制

1.6抗氧化功能

1.7辅助治疗恶性肿瘤

1.8抗衰老作用

1.9增强细胞免疫

1.10增强体液免疫

2羊胎盘肽生物学活性的研究进展

2.1羊胎盘肽的制备流程

2.2羊胎盘肽的理化性质

2.3羊胎盘肽的免疫调节作用

2.4延缓衰老的作用

2.5对皮肤的保健作用

2.6其他的生物功能

3细胞免疫反应检测方法的研究进展

3.1白细胞介素-2检测方法

3.2淋巴细胞转化检测方法

3.3先天性免疫细胞的检测

4本研究的目的和意义

试验一奶山羊胎盘肽的分离提纯

1材料与方法

1.1试验材料

1.2胎盘肽粗提物的的制备方法

2结果

3讨论

试验二用Tricine-SDS-PAGE电泳法初步鉴定奶山羊胎盘肽

1材料与方法

1.1试验材料

1.2方法

2结果

3讨论

试验三考马斯亮蓝G-250法测定胎盘肽的含量

1材料与方法

1.1试验材料

1.2方法

2结果

3讨论

试验四奶山羊胎盘肽对小鼠外周血血清白介素2含量的影响

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

3讨论

试验五奶山羊胎盘肽对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应的影响

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

3讨论

试验六奶山羊胎盘肽对小鼠脾脏NK细胞活性的影响

1材料和方法

1.1试验材料

1.2实验方法

2结果与分析

3讨论

验七奶山羊胎盘肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

3讨论

结论

参考文献

致谢

个人简介、攻读学位期间发表的论文