烟草核基质结合序列TM6在转基因植物中的功能鉴定及机理分析

摘要

核基质结合序列(Matrix Attachment Region，MAR)是真核生物基因组上一段富含A/T，且能够将DNA或染色质附着到核基质上的一段DNA序列。当染色体周围富集大量置换蛋白时，这些置换蛋白能特异识别并结合到MAR序列区域并替换掉H1组蛋白，使MAR区域的染色体形成一种易于调节因子及修饰因子接近的开放结构，因而MAR序列的出现使染色质上核小体处于松散状态，从而影响邻近基因的表达。根据研究推断，MAR在维持和/或修饰DNA或染色质结构及调控相关基因表达中发挥重要的作用。 TM6是本实验室从烟草核基质中分离得到的一段具有MAR结构特征的DNA序列。为了验证TM6在植物体内的功能，我们构建不同的植物表达载体转化烟草，对转基因烟草中外源基因的表达情况进行了分析检测。为了进一步研究TM6的作用机理，本实验分析了TM6周围的染色体区域活跃程度及TM6的结合蛋白与TM6相互作用关系，主要实验结果如下： 1.在双子叶植物烟草中，双端TM6序列均能显著提高表达盒中报告基因gusA的表达。虽然细胞类型对转基因表达有一定的影响，但并不影响TM6的调控功能。本实验将P35S，PPNZIP，PCOR及Pmini35S特异型启动子引入MAR研究，结果显示，TM6的作用依赖于启动子的类型，但TM6并不能改变启动子的作用模式。本实验结果为以后在转基因植物特定发育时期或特定器官中提高外源基因的表达提供了实验依据。 2.在转化烟草的过程中发现，连有TM6的载体其转化效率高于不连TM6的载体。通过对转基因烟草中卡那抗性基因的表达分析发现，抗性基因的表达量的高低与转化频率存在着直接的关系，因此推测TM6通过增加抗性基因的表达来提高了转化效率，同时这种转化效率的提高使抗性芽发生提前，数量增多，并且抗性苗的生长势也明显高于对照。 3.对TM6的缺失分析表明，TM6II(551-1193bp)区域是TM6的核心功能区，占TM6功能的79.1％。TM6II序列上的拓扑异构酶II结合位点、MRS区域及AT-box区域在调控基因表达上起到了协同作用。推测TM6通过序列上的拓扑异构酶II结合位点与植物体内的拓扑异构酶II相结合，从而促进T-DNA插入位点附近的DNA解旋，进而一些外源的调控元件识别并结合到TM6上的AT富含区及ARS区，同时加快外源基因的复制和转录。 4.烟草TM6序列能够显著提高侧翼启动子区对核酸酶的敏感性。在微球菌核酸酶(MNase)处理后的转TM6的转基因烟草细胞核内，TM6显著降低了35S和NOS启动子区域的特异扩增水平，说明TM6能够使邻近启动子区域DNA结构松散，便于外源转录因子的结合从而开启外源基因表达。 5.从烟草cDNA文库中分离到两个TM6序列的潜在结合蛋白NtMBP1和NtHMGB，凝胶阻滞(EMSA)分析表明这些蛋白能够与TM6片段体外结合。在竞争性EMSA实验中，蛋白NtDBP1和NtHMGB分别特异结合到TM6II的两个不同区域TM6II-I(761-870 bp)和TM6II-II(934-1013 bp)。同时多种侯选靶位点竞争结合实验验证：NtHMGB能特异结合到TM6II上MRS区域，而NtDBP1蛋白在TM6II上可能有多个潜在的核基质结合位点，也间接说明TM6作用机理的复杂性。 6.根据以上的实验结论，对TM6作用模型进行推测：TM6周围的染色体区域与外源染色质调控蛋白(拓扑异构酶II等)识别并结合后，解开TM6染色体区域的高级结构从而使染色体敏感性增强。同时TM6结合蛋白(NtMBP1和NtHMGB等)将TM6II上特定位点的DNA双链释放，便于外源调控因子(RNA聚合酶和甲基化酶等)的结合从而增加外源基因表达。

目录

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论文说明：英文缩略词及中英文对照表

声明

引言

1核基质结合序列的研究现状

1.1细胞核内染色体的存在状态

1.2细胞核内核基质区域

1.3染色体Loop结构

1.4核基质结合序列（MAR）的分离与鉴定

1.5核基质结合序列的结构特征

1.6核基质结合序列的分类

1.7MAR结合蛋白

2核基质结合序列（MAR）对外源基因表达的影响

2.1 MAR对外源基因表达强度和差异的影响

2.2 MAR对外源基因沉默的影响

2.3 MAR对外源基因转化频率的影响

3在基因水平上MAR介导的调控功能的多样性

3.1 MAR提供活跃整合位点

3.2 MAR介导的转录水平调控

4在表观水平上MAR介导的调控功能的多样性

4.1 MAR介导的蛋白水平调控

4.2 MAR介导的染色质改变

5 MAR增强基因表达的作用机制

5.1 MAR介导的DNA甲基化调控

5.2 MAR介导的DNA loop效应

5.3 MAR介导的DNA解旋效应

5.4 MAR介导的核小体开放

6 MAR作用的分子机理

6.1染色质的开放模型

6.2提高外源基因整合的模型

6.3抑制配对作用的模型

7研究目的与意义

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1烟草TM6序列分析

2.2TM6在转基因烟草内对外源基因表达的影响

2.2.1 TM6在转基因烟草植株中的功能

2.2.2在转基因烟草中TM6对启动子的依赖性

2.3TM6对外源基因转化效率的影响

2.3.1 T0代转基因烟草抗性统计

2.3.2 T2代转基因烟草种子萌发实验

2.4TM6几个功能位点的突变分析

2.5酵母单杂交对烟草中TM6的结合蛋白的分离

2.5.1烟草TM6序列的分段克隆及其酵母诱饵载体的构建

2.5.2烟草cDNA文库的获得及其酵母单杂交分析

2.5.3阳性克隆序列分析

2.6酵母单杂交蛋白NtMBP1和NtHMGB与TM6Ⅱ的互作分析

2.6.1 NtMBP1基因和NtHMGB基因的序列分析

2.6.2 NtMBP1和NtHMGB蛋白的亚细胞定位分析

2.6.3 NtMBP1和NtHMGB蛋白的原核表达及纯化

2.6.4烟草NtMBP1和NtHMGB蛋白与TM6Ⅱ—Ⅰ和TM6Ⅱ—Ⅱ片段的体外结合实验

2.7 TM6侧翼启动子区对微球菌核酸酶敏感性分析

3讨论

3.1TM6在单子叶植物和双子叶植物中都能提高外源基因表达

3.2TM6的依赖于启动子类型,但不能改变启动子的作用模式

3.3TM6能提高外源基因转化效率

3.4TM6的核心作用序列分析结果

3.5 MAR结合蛋白的多样性

3.6酵母单杂交系统在MAR功能研究中的应用

3.7 MAR序列作用模式的探讨

4结论

参考文献

附录:常用缓冲液及培养基的配制

致谢

攻读学位期间发表的学术论文: