利用反向Ras拯救恢复系统筛选拟南芥G蛋白互作因子

摘要

异三聚体G蛋白是在从酵母到人的所有真核生物中都高度保守的信号转导蛋白。它与偶联的膜受体蛋白和效应器蛋白合作，接受外界信息，并经过调整、集合与放大，准确无误地传递到细胞内，从而调控基本的生命过程，是细胞与环境信息交换必不可少的分子开关。异三聚体G蛋白属于GTPase，由α，β，γ三个亚基组成。研究表明，异三聚体G蛋白与含有七次跨膜结构域的质膜受体密切偶联(GPCRs)。目前哺乳动物中已发现大于20个Gα亚基，多于5个Gβ亚基，至少20个Gγ亚基。 与哺乳动物相反，植物异三聚体G蛋白含有一个Gα亚基(GPA1)，一个Gβ亚基(AGB1)和两个Gγ亚基(AGG1和AGG2)。研究表明，植物G蛋白参与许多激素、发育及环境信号的应答，从而调控植物生长、器官发育及病害及逆境抗性等。对于拟南芥和水稻研究表明，异三聚体G蛋白能够直接地，间接地组织特异性地影响生长素、ABA、GA、油菜素内酯(brassinosteroid)、鞘脂(sphingolipid)、D-葡萄糖信号、感受蓝光和病原菌信号传导等。虽然植物异三聚体G蛋白涉及广泛的信号转导过程，但已知的与Gα亚基或Gβγ二聚体相互作用的下游效应器还很少。但传统的方法，包括生物数据分析、遗传学与药理学等方法，对于筛选、鉴定植物G蛋白信号转导途径中的其它效应因子并不十分有效，因而寻找新的改良方法是必须的。 在本项研究中，构建了拟南芥cDNA文库，借助酵母反向Ras恢复系统(reverseRas Recruitment system，rRRS)来筛选、鉴定与拟南芥GPA1相互作用的蛋白因子，如ADL1C，ACC1，AtXB31等，并以AtXB31作为进一步的研究对象，通过Pull down，BiFC和CoIP等体外与体内蛋白结合实验证明了AtXB31同GPA1的互作。生物化学分析与异位过量表达，病原菌接种等遗传学研究进一步验证它们之间的相互作用。分离GPA1相互作用蛋白的突变体以及与包括gpa1在内的其它信号蛋白突变基因构成的双突变体。通过鉴定这些突变体对已知G蛋白介导的信号转导事件产生的效应与表型性状，揭示G蛋白信号转导途径的机理。取得的结果如下： 1.提取拟南芥2星期和三星期幼苗，成熟的叶片、茎、花的总RNA，以随即引物为反转录引物，表达载体为pUra-Ras，构建了cDNA文库，1×105个克隆。 2.构建pMet-WtGPA1，pMet-Q222L两种诱饵，借助反向Ras拯救恢复系统，筛选得到若干GPA1推论的互作因子，如：ADL1C，ACC1，AtXB31等。 3.通过酵母双杂交，Pull down，BiFC，CoIP等体内体外蛋白互作实验，进一步证明AtXB31同GPA1的互作。其中酵母双杂交的互作发现，AtXB31的N-末端膜定位序列对于二者的互作是必需的。 4.对于AtXB31结构分析表明，该基因具有三个保守domain，分别为：N-末端的膜定位序列，将蛋白定位在质膜上；锚定重复序列(ankyrin repeats)，参与蛋白互作；C3HC4的环形锌指结构，具有潜在的E3连接酶的活性。生物信息学预测该蛋白不具有跨膜结构。RT-PCR检测，该基因在植物的重要组织中均有表达，其中在花中表达较高。GFP亚细胞定位在质膜上。经ABA和病原菌处理之后，AtXB31表达量提高。 5.AtGPA1同AtXB31有可能共同调控病原菌Xcc8004信号途径。通过对AtXB31的异位过表达和RNAi敲除转基因植株同野生型col-o形态学比较发现，基本没有差别。分别对GPA1的无义突变体gpa1-4和AtXB31过表达以及RNAi敲除植株接种病原菌，野生型作为对照。结果表明，gpa1-4和atXB31RNAi敲除植株均出现了疑似感病症状。并且已经证明AtXB31在转录水平上响应该病原菌。因此推论AtGPA1和AtXB31很有可能参与Xcc8004病原菌的信号调控。 黄单胞菌是可造成植物严重病害的细菌，如黑腐病。因此研究该病原菌同植物之间的信号传递途径，找出关键调控基因，对于防治该病原菌可提供重要理论依据。 筛选、鉴定植物G蛋白相互作用因子，并剖析其生理功能和在G蛋白信号转导中的作用，从而揭示植物G蛋白信号转导过程中的分子运转机制，这不但具有深远的理论意义，而且具有现实的生产指导意义，为提作物高光合效率，改良作物品质，提高作物抗逆性等品种改良工作提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略表

声明

1前言

1.1异三聚体G蛋白信号转导研究进展

1.1.1哺乳动物异三聚体G蛋白

1.1.2异三聚体G蛋白模式

1.1.3植物异三聚体G蛋白

1.1.4植物G蛋白的组成成分

1.1.5植物G蛋白响应众多信号途径

1.2蛋白互作研究进展

1.2 1 Gal-4酵母双杂交

1.2.2酵母单杂交系统

1.2.3酵母三杂交系统

1.2.4酵母四杂交系统

1.2.5逆向双杂交系统

1.2.6泛素分离系统

1.2.7 RRS和rRRS酵母双杂交系统

1.3拟南芥XBAT家族基因研究进展

1.3.1 N-末端肉豆蔻酰基化

1.3.2锚蛋白重复序列(ANK)

1.3.3拟南芥E3 ligase

1.4植物先天免疫研究进展

1.4.1植物多层次的防卫反应

1.4.2 PAMP激活的免疫反应

1.4.3毒性病原菌抑制PAMP激活的免疫反应

1.4.4效应蛋白激活的免疫反应

1.4.5植物先天免疫与动物先天免疫

1.4.6黄单胞菌与植物互作的研究进展

1.6本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3酶和生化试剂

2.1.4实验引物

2.2实验方法

2.2.1拟南芥cDNA文库的构建

2.2.2 Reverse RAS RecruitmentSystem酵母双杂交

2.2.3互作因子的鉴定

2.2.4植物表达载体的构建与转化

2.2.5拟南芥的培养，转化与筛选

2.2.6病原菌的培养与接种

2.2.6 ABA处理

3结果与分析

3.1拟南芥cDNA文库的构建

3.1.1拟南芥总RNA的提取

3.1.2 mRNA的分离

3.1.3 cDNA的合成

3.1.4 cDNA与pUra表达载体的连接与转化

3.2 Reverse RAS Recruitment System酵母双杂交

3.2.1 Bait的构建与转化

3.2.2酵母双杂交的初步筛选

3.2.3酵母双杂交的二次筛选

3.2.4酵母双杂交阳性克隆的鉴定

3.3AtXB31基因的克隆及功能鉴定

3.3.1 AtGPA1推论互作因子AtXB31的获得

3.3.2.AtXB31基因的克隆

3.3.3 AtXB31蛋白的二级结构及功能性预测分析

3.3.4 XB家族基因之间的比较分析

3.3.5 AtXB31亚细胞定位

3.3.6 RT-PCR检测AtXB31的表达

3.3.7正义以及RNAi转基因植株的鉴定

3.3.8 Xcc8004病原菌接种分析

3.4 AtXB31同AtGPA1体内体外蛋白互作的验证

3.4.1酵母双杂交

3.4.2 Pull down

3.4.3免疫荧光蛋白互作：BiFC

3.4.4免疫共沉淀：CoIP

4讨论

4.1植物G蛋白响应众多信号途径

4.2反向Ras拯救恢复系统适合研究植物蛋白互作

4.3 AtXB31的结构与功能特征

4.4 AtXB31同AtGPAl体外与体内互作的验证

4.5 AtXB31和AtGPA1与病原菌Xcc8004的信号转导

5结论

参考文献

附录

致 谢

攻读学位期间发表论文情况