PRRSV高变异株与美洲标准株VR-2332NSP2蛋白的表达与免疫原性鉴定

摘要

PRRS是在20世纪80年代发现的一种动物传染病，此病每年给世界养猪业造成的损失达几十亿美元，间接损失难以计算。由于不同PRRSV分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，给PRRS的准确检测和有效控制带来困难。本研究目的为通过分离和鉴定一株高变异PRRSV野毒株，构建和表达变异株和美洲标准株NSP2蛋白，建立ELISA方法用于区分灭活苗免疫猪与自然感染猪，为有效防控PRRSV，合理制定免疫程序提供依据。 根据GenBank发表的PRRSVVR-2332毒株的基因序列，本研究针对NSP2基因设计了二对引物，利用RT-PCR方法，成功扩增出本实验室分离的PRRSV TA-12毒株的NSP2全基因。利用DNAStar软件分析NSP2蛋白的抗原表位，将NSP2基因共划分四个片段，按N端保守区划分两个片段，中间高变区为一个片段，C端保守区为一个片段，设计了四对带有酶切位点的引物，分别构建了重组质粒，将重组质粒转化到表达菌株BL21plys中，对重组菌进行诱导后，经过Western blot鉴定，结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达。同时使用扩增TA-12NSP2高变区的引物RT-PCR扩增得到美洲标准株VR-2332 NSP2的对应基因片段，成功在宿主菌中表达。本实验进一步选择TA-12N端保守区，高变区纯化的重组蛋白为抗原，建立ELISA方法检测本实验收集的400份猪血清。ELISA结果显示PRRSV NSP2基因的中间区域突变株TA-12和美洲标准株的抗原表位具有不同的免疫原性，推测可以利用NSP2蛋白区分PRRSV突变株与标准株，为PRRSV的免疫监测提供依据。

目录

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引言

1.1 PRRS病毒的分子生物学研究进展

1.2 PRRSV病毒的免疫学特点

1.3 PRRSV的致病机理

1.4 PRRSV的遗传变异

1.5 PRRSV的防控技术

1.6本研究的目的和意义

一.病毒的分离鉴定

1.1.实验材料和方法

1.1.1病料

1.1.2试剂

1.1.3细胞

1.1.4引物的设计

1.1.5组织中PRRSV N蛋白基因的扩增

1.1.6 Marc-145细胞分离病毒

1.2实验结果

1.2.1PRRSV的ORF7基因的扩增

1.2.2测序结果

1.2.3Marc-145细胞分离病毒

1.2.4 TCID50结果

1.3.讨论

二.NSP2全基因的扩增及序列分析

2.1材料和方法

2.1.1试剂

2.1.2细胞和培养基

2.1.3浓缩病毒

2.1.4提病毒RNA

2.1.5 NSP2基因的扩增

2.2.实验结果与分析

2.2.1.PRRSV NSP2基因的扩增

2.2.2重组质粒PCR鉴定结果

2.2.3测序结果分析

2.3.讨论

三.NSP2蛋白的分段表达

3.1材料和方法

3.1.1重组质粒

3.1.2试剂

3.1.3表达菌株

3.1.4 NSP2表达片段的划分

3.1.5引物

3.1.6表达重组质粒的构建

3.1.7诱导表达目的蛋白

3.1.8诱导蛋白的鉴定

3.2.实验结果与分析

3.2.1 NSP2表达片段的划分

3.2.2表达载体的构建

3.2.3目的蛋白的表达与分析

3.3讨论

四.建立间接ELISA检测方法

4.1材料和方法

4.1.1.血清样品

4.1.1抗原

4.1.2 ELISA板

4.1.3酶标二抗

4.1.4纯化抗原

4.1.5 ELISA检测血清样品

4.2.实验结果与分析

4.2.1抗原纯化结果

4.2.2 ELISA实验结果与分析

4.3.讨论

结论

参考文献

附 表

致谢