蓝耳病毒RX株的分离鉴定和中药体外抗病毒的作用研究

摘要

本研究通过设计PRRSV PCR特异性引物，利用RT-PCR方法对广东地区某疑似暴发PRRS的猪场进行检测，结果为PRRSV阳性。然后用Marc-145细胞对发病猪肺脏、淋巴结进行病毒分离。从肺脏中分离得到一株病毒命名为PRRSV RX株。试验对分离病毒进行了鉴定，电镜观察结果可见胞浆内散布大量呈球形的病毒粒子，直径为40-60nm；病毒的TCID50为10-4.5/0.1 ml。病毒为RNA病毒；RX株经56℃处理20-30min后丧失对细胞的感染力；病毒培养的最佳PH值是6.8-7.0。病毒动物回归试验表明，分离病毒接种40日龄的仔猪，临床表现体温升高和一定程度的呼吸症状。 选用黄芪、板蓝根、甘草、鱼腥草、山楂和青蒿六种中草药和为试验药物进行体外抗病毒试验。中草药采用传统的水煮浸提法分别提取并浓缩成100mg/ml溶液作为原液，高压灭菌处理备用。药物原液倍比稀释成不同浓度以测定其对Marc145细胞的毒性作用，来确定药物的安全浓度。以安全浓度为准，稀释成四个不同浓度在Marc145细胞上做抗病毒试验；采用三种作用方式：先加药物后加病毒，先加病毒后加药物，药物与病毒先作用一段时间后加入，以CPE、病毒滴度和MTT法测得的OD值为观测指标评价药物抗PRRSV病毒的活性，以探讨其抗病毒吸附、抗病毒复制或直接灭活病毒的作用方式。试验结果如下： 各药物对Marc145细胞的安全浓度分别为黄芪12.5 mg/mL、板蓝根3.125 mg/mL、甘草3.125 mg/mL、山楂3.125 mg/mL、鱼腥草1.526 mg/mL、青蒿1.526 mg/mL。 所筛选药物黄芪，板蓝根，甘草，山楂，鱼腥草，青蒿都具有抗病毒吸附作用而且保护作用均显著；先加病毒后加药物时，鱼腥草的作用比较稳定而板蓝根在3.125 mg/mL，1.562 mg/mL保护率最高。药物对病毒的杀灭作用时板蓝根在3.125 mg/mL，1.562 mg/mL的作用比较明显。不同药物对同种细胞的毒性不一样。 综合三种加药方式的效果考虑，板蓝根、青蒿能够抑制病毒，对细胞的保护率较高。

目录

文摘

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论文说明：符号及缩略词

声明

引言

1.历史及分布

2.病原学

3.流行病学

4病毒疾病的预防与治疗

4.1免疫预防

4.2药物治疗

4.3中药抗病毒的研究进展

4.4中药在抗动物病毒中的应用

4.5具有抗病毒作用的复方中药及制剂

4.6中药在治疗突发病毒性疾中的应用

4.7抗病毒药物的作用机制

4.8中草药抗病毒作用机制

4.9抗病毒中草药的筛选方法

实验一 PRRSV RX株分离及初步鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2实验结果

2.1电泳及测序

2.2细胞传代分离病毒结果

2.3病毒间接免疫荧光鉴定

2.4病毒形态透射电镜观察结果

2.5病毒液在Marc145上的TCID50

2.6病毒的理化试验

2.7动物回归试验

3讨论

3.1病毒的分离

3.2病毒的电镜观察

3.3病毒的理化实验

3.4载体

3.5动物回归实验

4结论

4.1 PRRSV特异性RT-PCR检测方法的建立

4.2 PRRSV RX株的分离和初步鉴定

实验二 中药体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

1.3数据处理

2实验结果

2.1病毒液在Marc145上的TCID50

2.2药物安全浓度

2.3药物抗病毒试验

3讨论

3.1中药的前处理

3.2中药提取物在Marc145上的安全浓度

3.3中药抗病毒的活性作用

4结论

参考文献

致谢