疏绵状嗜热丝孢菌超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的克隆和表达及性质研究

摘要

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutasc，简称SOD)(EC.1.15.1.1)系一类金属酶，广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子(O2-)发生歧化反应，从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中，发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同，超氧化物歧化酶主要可分为CuZn-SOD(存在于真核生物中)，Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物中)，Fe-SOD(存在于原核生物和高等植物的叶绿体中)等类型。 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一种广泛分布的嗜热真菌，其生长上限温度很高，产生的嗜热酶在高温条件下具有很高的活性和稳定性，目前已从该菌中分离纯化了热稳定的蛋白酶、几丁质酶和纤维素酶等。该菌在含有干酪素的培养基中，50℃条件下可以产生超氧化物歧化酶。 本研究以疏绵状嗜热丝孢菌为材料，根据本实验室已获得的超氧化物歧化酶Mn-SOD基因的序列，通过RACE技术克隆得到了疏绵状嗜热丝孢菌的超氧化物歧化酶Mn-SOD的基因mnsod，该基因全长cDNA序列为791bp，包括654bp的ORF，编码217个氨基酸。该基因已在GenBank中注册，登录号为EU364837。 将超氧化物歧化酶Mn-SOD的基因与酵母表达载体pPIC9K用EcoRI和NotI双酶切后体外连接构建了重组酵母表达载体pPIC9K/mnsod，转化巴斯德毕赤酵母获得了产Mn-SOD的酵母工程菌株MS-95。 通过甲醇诱导，对酶液进行硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析获得了凝胶电泳均一的分子量约为27kDa的超氧化物歧化酶。表达的超氧化物歧化酶Mn-SOD的最适反应温度和pH分别为55℃和8.0，该酶具有良好的热稳定性；在pH值为7.0～9.0之间保持稳定的酶活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

引言

1超氧化物歧化酶的研究进展

1.1 SOD的发现与命名

1.2 SOD的分布与类型

1.3 SOD的结构与性质

1.4 SOD的分子生物学

1.5 SOD的功能及应用

1.6热稳定性超氧化物歧化酶的研究进展

2本研究的立题依据、研究内容和技术路线

2.1立题依据

2.2研究内容

2.3技术路线

第二章 疏绵状嗜热丝孢菌超氧化物歧化酶Mn-SOD基因的克隆及序列分析

1材料和方法

1.1实验材料

1.2疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因的cDNA的克隆及序列分析

1.3疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因的Genomic DNA的克隆及序列分析

2结果与分析

2.1疏绵状嗜热丝孢菌总RNA的提取

2.2疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因cDNA 5’-末端的分离

2.3疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因ORF的分离及扩增片段的序列拼接

2.4疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD Genomic DNA的分离

2.5疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因的核苷酸和氨基酸序列分析

3小结与讨论

第三章 疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因在毕赤酵母中的表达

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 Mn-SOD成熟肽基因序列的分离

2.2超氧化物歧化酶Mn-SOD基因在毕赤酵母中的表达

3小结与讨论

3.1巴斯德毕赤酵母表达系统的选择

3.2分泌表达方式的选择

3.3甲醇利用表型(Mut+和Muts)的选择

3.4影响毕赤酵母外源蛋白表达量的因素及表达条件的优化

第四章 疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD基因分泌表达产物的纯化及其性质研究

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1表达超氧化物歧化酶Mn-SOD的纯化及SDS-PAGE检测

2.2表达超氧化物歧化酶的种类测定

2.3表达超氧化物歧化酶Mn-SOD的酶学性质研究

3小结与讨论

3.1表达超氧化物歧化酶的纯化

3.2表达超氧化物歧化酶的性质

结论与建议

参考文献

致 谢