叶籽银杏叶生雌性生殖器官发育相关基因的克隆与序列分析

摘要

银杏（Ginkgo biloba L.）系第四纪冰川之后惟一在中国保存下来的一孑遗种子植物。在其漫长的演化历程中，银杏的种子和叶片发生了明显的形态变异。1891年，Shirai在日本发现了世界上第一株叶籽银杏（Ginkgobiloba L.var.epiphylla Mak.）。作为银杏家族中的特异种质，叶籽银杏具有重要的观赏价值和科研价值。本实验室已对叶籽银杏的分类地位和系统发育进行了研究，然而对于叶籽银杏的发生机制还没有确切的定论。
　　 本研究以叶籽银杏和银杏为研究试材，对其LEAFY同源基因和GbMADS5基因进行了克隆、分析。主要研究结果如下：
　　 1.利用改良的CTAB法提取叶籽银杏和银杏的基因组DNA。经电泳检测，片段大小在23kb左右，DNA带整齐清晰，没有明显拖尾，提取的DNA纯度较高。用CTAB大量法提取叶籽银杏的RNA，电泳检测显示，28SRNA和18SRNA电泳条带清晰，不拖尾，并且28SRNA的亮度高于18SRNA的亮度，表明RNA完整性较好，没有降解。能用于分子克隆等后继分子生物学实验。
　　 2.用RT-PCR扩增的叶籽银杏GinLFYcDNA序列编码区全长为1209bp，用DNmman软件分析该序列显示其编码402个氨基酸，将该序列在GeneBank上注册，注册序列号为：GU563897。经BLAST分析表明，叶籽银杏GinLFY的cDNA序列与辐射松的PRFLL基因同源性是85％，罗汉松LEAFY基因的同源性为82％。与已注册银杏雌株的GinLFY基因核苷酸序列及氨基酸序列的同源性都高达99％。叶籽银杏的GinLFY基因组序列全长为3455bp，与cDNA序列多重比对后，该基因组序列含有2个内含子，3个外显子，大小分别为479bp、404bp和326bp。
　　 叶籽银杏GinNdly cDNA序列编码区全长为1209bp，用DNAman软件分析该序列，编码402个氨基酸。将该序列在GeneBank上注册，注册序列号为：GU563898。经BLAST分析表明，叶籽银杏GinNdly cDNA序列与红豆杉的NEEDLY-like基因，日本柳杉CjNdly基因，罗汉松的NEEDLY-like基因的同源性分别为：86％、83％、84％。与已注册银杏GinNdly基因核苷酸及氨基酸序列的同源性也都高达99％。叶籽银杏的GinNdly基因组序列全长为1504bp，与cDNA序列多重比对后，该基因组序列也含有2个内含子，3个外显子，大小分别为：449bp、428bp和332bp。
　　 3.测得的叶籽银杏GbMADS5基因序列含有666bp，将该序列在GeneBank上注册，注册序列号为：GU563899。序列分析表明该基因含有一个完整的开放阅读框，编码221个氨基酸，含有MADS区、I区、K区和C-末端，具有典型的MIKC型植物MADS-box基因结构。同源性比较显示，GbMADS5与苏铁AG、云杉DAL2、拟南芥AGL11的同源性分别为91.07％、83.33％、60.87％。构建的系统树显示，叶籽银杏的GbMADS5基因归于AG亚家族基因，与苏铁的亲缘关系最近。
　　 本文对叶籽银杏的LEAFY同源基因及MADS-box基因进行了研究探讨。该研究对叶籽银杏这一观赏资源的保护、利用和开发具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1.引言

1.1 植物开花相关基因

1.1.1 花分生组织特征基因

1.1.2 调节花器官形成基因

1.2 LEAFY基因与其同源基因的研究进展

1.2.1 LEAFY基因是花分生组织特征基因

1.2.2 LEAFY基因的表达调控

1.2.3 LEAFY基因在成化过程中的作用

1.2.4 LEAFY同源基因的研究

1.3 MADS-box基因研究进展

1.3.1 MADS-box基因的结构特点

1.3.2 MADS-box基因在胚珠发育中的作用

1.3.3 AG-like亚家族基因研究概述

1.3.4 裸子植物中MADS-box基因的研究

1.4 研究目的和意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器及试剂

2.2.1 主要仪器

2.2.2 试剂

2.2.3 试剂配制

2.3 实验方法

2.3.1 叶籽银杏基因组DNA的提取

2.3.2 叶籽银杏总RNA的提取及cDNA的合成

2.3.3 DNA和总RNA的检测

2.3.4 PCR引物设计

2.3.5 叶籽银杏GinLFY基因cDNA序列扩增

2.3.6 叶籽银杏GinNdly基因cDNA序列扩增

2.3.7 叶籽银杏GinLFY基因基因组序列扩增

2.3.8 叶籽银杏GinNdly基因基因组序列的扩增

2.3.9 叶籽银杏GbMADS5基因cDNA序列扩增

2.3.10 银杏的GinLFY和GYnArdly基因基因组序列的克隆

2.3.11 PCR产物的回收与纯化

2.3.12 DNA片段的连接

2.3.13 E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）

2.3.14 质粒的转化

2.3.15 阳性克隆鉴定及序列测定

3.结果与分析

3.1 DNA的提取

3.2 RNA的提取

3.3 基因的克隆

3.3.1 叶籽银杏GinLFY基因cDNA序列的克隆

3.3.2 叶籽银杏和银杏GinLFY基因基因组序列的克隆

3.3.3 叶籽银杏GinNdly基因cDNA序列的克隆

3.3.4 叶籽银杏和银杏G.inNdly基因基因组序列的克隆

3.3.5 叶籽银杏GbMADS5基因cDNA序列的克隆

3.4 序列分析

3.4.1 叶籽银杏GinLFY基因cDNA序列分析

3.4.2 叶籽银杏GgnNdly基因cDNA序列的分析

3.4.3 叶籽银杏和银杏GinLFY基因基因组序列的分析

3.4.4 叶籽银杏和银杏GYnNdly基因基因组序列的分析

3.4.5 叶籽银杏GbMADS5基因cDNA全长序列的分析

4.讨论

4.1 叶籽银杏基因组DNA和RNA的提取

4.2 叶籽银杏LEAFY同源基因的分析

4.3 叶籽银杏AG-like亚家族基因的分析

4.4 叶籽银杏的发生机制

5 结论

5.1 叶籽银杏基因组DNA的提取

5.2 叶籽银杏RNA的提取

5.3 叶籽银杏LEAFY同源基因的分析

5.4 叶籽银杏GbMADS5基因序列分析

5.5 本研究的主要创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况