黄瓜Rubisco与Rubisco活化酶对低温弱光的响应与适应

摘要

核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是催化光合碳循环和光呼吸第一步反应的关键酶，在调节光合速率中发挥重要作用，该酶需要进行氨甲酰化并与Mg2+结合才具有催化活力。Rubisco在体内的活化需要Rubisco活化酶（RCA）的促进。本文以‘津优3号’黄瓜为试材，研究低温弱光下黄瓜幼苗Rubisco、RCA活性及其基因表达量的变化，日光温室黄瓜Rubisco、RCA活性及基因表达特性。主要结果如下：
　　 1.亚适温弱光（ST+LL）和低温弱光（LT+LL）处理的单株叶面积和干物重均明显减小。处理初期光合速率（Pn）、Rubisco活性及其大亚基（rbcL）、小亚基（rbcS）基因表达、RCA活性与基因（CsRCA）表达量大幅度降低，5～7d后，ST+LL处理的缓慢回升，而LT+LL处理的持续下降，表明黄瓜光合机构对亚适温弱光环境有逐步适应机制。Rubisco和RCA活性及其基因表达对低温弱光的响应与Pn基本一致，可见，低温弱光下RCA和Rubisco活性及其基因表达量下降是黄瓜幼苗Pn降低的重要原因。
　　 2.适宜温度下，黄瓜幼苗Pn和RCA活性随着光量子通量密度（PFD）的降低而减小，100μmol·m-2·S-1弱光处理可使Rubisco初始活性和总活性明显降低，而300μmol·m-2·s-1亚弱光处理的与CK差异不显著。随着PFD减弱，rbcL mRNA相对表达量逐渐增加，而rbcS的逐渐减小。100μmol·m-2·s-1弱光和300μmol·m-2·s-1亚弱光处理均使CsRCA相对表达量明显增加。弱光处理的Chl b含量增加，Chl a/b明显降低，而亚弱光处理的色素含量与CK差异不显著。
　　 3.日光温室黄瓜功能叶片的Pn呈明显的季节变化，9月17日～12月20日Pn与PFD和气温（Ta）成正相关。Rnbisco和RCA活性及rbcL、rbcS、CsRCA相对表达量与Pn的变化规律相似。
　　 4.5月20日晴天条件下测定的日光温室黄瓜Pn日变化呈双峰型，高峰分别出现在11:00和13:00，说明此时存在午休现象。Rubisco总活性日变化呈单峰型，12:00出现高峰；Rubisco初始活性日变化为双峰型，分别在12:00和16:00出现高峰，而RCA活性中午时段的变化平稳。rbcL相对表达量日变化呈单峰型，最大值出现在16:00；而rbcS和CsRCA的呈双峰型，高峰分别出现在12:00和16:00。
　　 5.日光温室黄瓜中位叶（第4～8叶）的Pn、Rubisco初始活性、总活性和RCA活性明显高于下位叶（第12叶）和上位叶（第1叶）。第4叶、8叶、第12叶和第1叶的rbcL相对表达量依次降低；rbcS相对表达量则是4叶、1叶、8叶和12叶的依次降低；而CsRCA相对表达量随着叶位的下降而升高。
　　 6.通过RT-PCR技术克隆了RCA基因的一个长562bp片段，构建了原核表达载体，经过IPTG诱导后表达1条分子量约27.15kD的特异蛋白，为下一步制作抗体进行western blot分析RCA在蛋白水平上的表达奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写符号及英文对照表

1 引言

1.1 低温弱光对植物光合作用的影响

1.2 Rubisco与光合作用的关系

1.2.1 Rubisco的生物学特性

1.3 RCA与光合作用的关系

1.3.1 RCA的分子特性

1.3.2 RCA与Rubisco的相互作用

1.4 环境生态因子对Rubisco与RCA的影响

1.4.1 光照

1.4.2 温度

1.4.3 CO2浓度

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 酶及生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.2 试验设计

2.2.1 黄瓜幼苗Rubisco与RCA对低温弱光的响应

2.2.2 黄瓜幼苗Rubisco与RCA对适温弱光的响应

2.2.3 日光温室黄瓜Rubisco与RCA的基因表达特性

2.3 测定方法

2.3.1 生长量

2.3.2 叶绿素色素含量测定

2.3.3 光合速率

2.3.4 Rubisco与RCA活性

2.3.5 Rubisco和RCA基因表达

2.3.6 原核载体构建方法步骤

2.3.7 原核表达载体的诱导表达

2.4 数据分析

3 结果与分析

3.1 黄瓜幼苗Rubisco与Rubisco活化酶对低温弱光的响应

3.1.1 低温弱光对黄瓜幼苗生长量的影响

3.1.2 低温弱光对黄瓜幼苗光合速率的影响

3.1.3 低温弱光对黄瓜幼苗Rubisco活性及其基因表达的影响

3.1.4 低温弱光对黄瓜幼苗叶片RCA活性及其基因表达的影响

3.2 黄瓜幼苗Rubisco与Rubisco活化酶对弱光的响应

3.2.1 弱光对黄瓜幼苗光合速率的影响

3.2.2 弱光对黄瓜幼苗Rubisco活性及其基因表达的影响

3.2.3 弱光对黄瓜幼苗叶片RCA活性及其基因表达的影响

3.2.4 弱光对黄瓜幼苗叶片色素含量变化

3.3 日光温室黄瓜Rubisco与Rubisco活化酶基因表达特性

3.3.1 Pn时期变化

3.3.2 Rubisco、RCA活性与基因表达的时期变化

3.3.3 日光温室黄瓜叶片光合速率日变化

3.3.4 日光温室黄瓜叶片Rubisco、RCA活性与基因表达日变化

3.3.5 日光温室黄瓜不同叶位叶片光合速率

3.3.6 日光温室黄瓜不同叶位叶片Rubisco、RCA活性与基因表达

3.4 黄瓜Rubisco活化酶基因原核表达载体的构建

3.4.1 RCA基因片段的克隆与连接

3.4.2 载体构建

3.5 重组蛋白表达与SDS-PAGE分析

4 讨论

4.1 低温弱光下黄瓜幼苗Rubisco与RCA活性及基因表达与光合速率的关系

4.2 日光温室黄瓜Rubisco、RCA活性及基因表达特性与光合速率的关系

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文