禽白血病病毒J亚群、B亚群的分离鉴定及核酸探针的制备

摘要

禽白血病（Avian Leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。禽白血病病毒群分为A、B、C、D、E、J等共10亚群。近年来，J亚群禽白血病在我国呈流行性爆发，对我国养禽业造成巨大的经济损失。目前，国内外尚无有效的疫苗和药物用于防治本病。世界各国控制禽白血病的主要措施是通过病原检测，淘汰阳性鸡，从而净化种群消灭本病。但由于禽白血病毒gp85基因极易发生抗原变动，现有ALV抗体检测试剂盒不能保证检测到所有中国株ALV抗体。基于此，建立适合我国ALV感染的快速诊断方法显得尤为必要。
　　 本实验通过血清学ELISA、病理学以及病毒分离，获得ALV-B和ALV-J各两株分离株，并在国内首次从感染ALV-J的海蓝白商品蛋鸡群中分离到B亚群禽白血病病毒（ALV-B），同时证实了ALV-B、ALV-J在同一鸡只体内的混合感染。对该鸡场血清样品（92份）ELISA检测显示：ALV-A/B型抗体阳性率为16.3％，ALV-J抗体阳性率为13％，其中有1只鸡呈现抗体双阳性；病理组织学观察显示，在肝脏同一位置发现淋巴细胞样瘤细胞和髓细胞样瘤细胞增生灶，其它组织器官（除脑、神经和法氏囊）也有不同程度的两种瘤细胞增生；合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特异性引物进行PCR检测，获得1100bp的ALV-B特异性片段和924bp的ALV-J特异性片段，而MDV和REV检测为阴性。在同一只鸡中出现ALV-B和ALV-J双阳性，分离得到ALV-B和ALV-J各两毒株；对ALV-B、ALV-J扩增序列进行遗传进化树分析表明，两ALV-B分离株与其代表株的同源性分别为92.8％和93.0％；两ALV-J分离株与英国原型株同源性分别为96.9％和91.5％，与美国原型株同源性为85.9％和81.5％，与国内分离毒株同源性在87.0％～98.7％之间。
　　 基于ALV群内混合感染的出现，制备了通用探针和ALV-J核酸探针，运用斑点杂交方法对禽白血病B、J亚群和马立克氏病、网状内皮增生症进行检测诊断。根据GenBank中已经发表的ALV各亚群基因的序列，筛选比较各亚群gag基因和env囊膜基因，直接合成核酸探针的目的片段，利用随机引物法标记物地高辛（DIG）制备了ALV通用核酸探针和J亚群核酸探针；通过斑点杂交检测方法对此探针特异性进行验证，检测结果显示：该探针能与标准毒株ALV核酸发生特异性杂交，而与对照的未接毒DNA、禽网状内皮组织增生症病毒（REV）、马立克氏病病毒（MDV）核酸杂交反应为阴性，具有良好的特异性。特异性核酸探针的制备为我国ALV感染的快速诊断提供了新的思路和方法。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

英文缩略表

1 引言

1.1 禽白血病病毒研究现状

1.1.1 ALV的分子病毒学特性

1.1.2 ALV流行病学特点

1.1.3 ALV的病理变化

1.1.4 ALV免疫抑制机理

1.1.5 ALV-J和ALV-B致病性

1.1.6 ALV诊断防治

1.2 核酸探针分子杂交技术

1.2.1 核酸分子杂交简介

1.2.2 核酸分子杂交的基本操作程序

1.2.3 核酸探针的制备

1.2.4 核酸探针在疾病检测中的应用

1.3 研究目的及意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 仪器和试剂

2.1.2 参考毒株序列

2.1.3 试剂配制

2.2 方法

2.2.1 血清学检测

2.2.2 病理学观察

2.2.3 病毒分离

2.2.4 探针目的基因设计和合成

2.2.5 质粒的提取

2.2.6 质粒的酶切鉴定

2.2.7 核酸片段定量

2.2.8 地高辛随机引物法标记探针

2.2.9 探针标记效率的检测

2.2.10 探针特异性检测

2.2.11 斑点杂交检测

3 结果与分析

3.1 血清学检测ALV抗体结果

3.2 病理学观察结果

3.3 PCR检测结果

3.4 PCR产物的部分序列分析

3.5 质粒酶切鉴定结果

3.6 探针标记效率结果

3.7 ALV-J核酸探针特异性试验结果

3.8 通用核酸探针特异性试验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文