鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立和高蛋白表达细胞克隆株的研究

摘要

自1962年成功建立传代昆虫细胞系以来，昆虫细胞系己广泛地应用于生物学、农业和医学等领域，其中鳞翅目昆虫细胞系应用最为广泛，特别是随着杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression victor system，BEVS）的发明，使昆虫细胞在重组蛋白生产、工程疫苗和蛋白组学等领域得到了越来越多的应用，被认为是有巨大开发潜力的新型生物反应器。因此，建立新型昆虫细胞系、筛选用于病毒和重组蛋白生产等方面更加理想的细胞系，将具有重要的理论意义和实践价值。本文以重要农业害虫-棉铃虫（Helicoverpa armigera）和粘虫（Mrythimna separata）为材料建立新细胞系，并对其生物学特性进行研究，丰富了有限的昆虫细胞系资源，为离体条件下进行昆虫生理生化、杆状病毒感染和细胞凋亡机制的研究提供实验材料；同时对本实验室建立的高产悬浮性粉纹夜蛾（Trichoplusia，ni）胚胎细胞系QB-Tn9-4s进行克隆，从中筛选高蛋白表达的克隆株，进行无血清培养驯化，并阐明其生物学特性，为昆虫细胞这一新型生物反应器的深入研究和开发奠定基础。
　　 1.由棉铃虫胚胎组织建立了两株细胞系，分别命名为QB-Ha-E-1和QB-Ha-E-5，在含10％胎牛血清的TNM-FH培养基中已传代60余代。两株细胞系均以圆形和短梭形细胞为主；DAF和RAPD鉴定结果表明两株细胞系均来源于棉铃虫胚胎；染色体均为典型的鳞翅目昆虫细胞染色体特征；QB-Ha-E-1和QB-Ha-E-5的第30代细胞群体倍增时间分别为63.7 h和66.9 h。两株细胞系均能被棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）感染，4 d的感染率分别为86.6％和56.5％；对甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）核型多角体病毒（MbNPV）7 d的感染率均为15％左右；但对苜蓿银纹夜蛾（Autographacalifornica）核型多角体病毒（AcMNPV）侵染的反应不同，DAPI染色和基因组DNA电泳结果表明，AcMNPV可诱导QB-Ha-E-5细胞发生凋亡，极少数细胞内可形成病毒多角体，但不能诱导QB-Ha-E-1细胞发生凋亡，其感染率为55.3％，两株细胞系均可被1.25μg/mL的放线菌素D诱导发生凋亡。
　　 2.由粘虫胚胎组织建立了四株细胞系，分别命名为QB-Ms-E-1、QB-Ms-E-2、QB-Ms-E-3和OB-Ms-E-4，在含10％胎牛血清的TNM-FH培养基中已传代50余代。四株细胞系均以圆形和短梭形细胞为主；DAF和RAPD鉴定结果表明四株细胞系均来源于粘虫胚胎；染色体均呈典型的鳞翅目昆虫细胞染色体特征；QB-Ms-E-1、QB-Ms-E-2、QB-Ms-E-3和QB-Ms-E-4的群体倍增时间分别为44.9 h、46.6 h、46.5 h和47.1 h。四株细胞系均能被同源的粘虫核型多角体病毒（MsNPV）感染，7 d的感染率分别为56.6％、53.6％、49.3％和62.5％；对MbNPV10 d的感染率均在5％以下；但对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）都很敏感，4 d的感染率均在90％以上。
　　 3.对粉纹夜蛾胚胎细胞系QB-Tn9-4s进行克隆获得了9个克隆株，分别命名为克隆株QB-Tn-Ⅰ、QB-Tn-Ⅱ、QB-Tn-Ⅲ、QB-Tn-Ⅳ、QB-Tn-Ⅴ、QB-Tn-Ⅵ、QB-Tn-Ⅶ、QB-Tn-Ⅷ和QB-Tn-Ⅸ。对各克隆株基因组DNA进行RAPD鉴定，结果表明各克隆株与原始细胞系QB-Tn9-4s具有相同的DNA扩增谱带。病毒侵染试验表明，各克隆株对AcMNPV均很敏感，感染率都在87％以上，平均每个细胞病毒多角体产量在70～87个之间，其中克隆株QB-Tn-Ⅰ的多角体产量最高（86.7±1.5 OBs/cell），高于对照BTI-Tn5B1-4和原始细胞QB-Tn9-4s的多角体产量，是Sf-9多角体产量的2.8倍。比较各细胞第6 d重组蛋白β-半乳糖苷酶（β-gal）的表达量，克隆株QB-Tn-Ⅴ的表达量最高（3.06×104 IU/mL），其次为克隆株QB-Tn-Ⅱ（2.70x104 IU/mL），均高于原始细胞QB-Tn9-4s和对照细胞BTI-Tn5B1-4及Sf-9的表达量。比较各细胞克隆株第7 d分泌型碱性磷酸酶（SEAP）的表达量，克隆株QB-Tn-Ⅴ的表达量最高（2.96 IU/mL），其次为QB-Tn-Ⅰ（2.41 IU/mL），均显著高于原始细胞QB-Tn9-4s和对照细胞BTⅠ-Tn5B1-4及Sf-9的表达量。
　　 4.将原始细胞系QB-Tn9-4s及其克隆株QB-Tn-Ⅰ和QB-Tn-Ⅴ分别在无血清培养基Sf-900Ⅲ及EX-CELL420中进行驯化培养，在Sf-900Ⅲ中驯化均获得成功，而在EX-CELL420中只有克隆株QB-Tn-Ⅴ最终驯化成功。无血清驯化后各细胞形态和大小都发生了一定的改变。生长曲线测定结果表明，各细胞在Sf-900Ⅲ中的生长速度变快，群体倍增时间缩短，细胞最大密度均有提高，但是克隆株QB-Tn-Ⅴ在EX-CELL420中生长速度变慢，倍增时间延长，细胞最大密度有所下降。QB-Tn9-4s及克隆株QB-Tn-Ⅰ和克隆株QB-Tn-Ⅴ在有血清培养基TNM-FH中的群体倍增时间分别为27.4 h、28.0h和27.0 h，在Sf-900Ⅲ中的倍增时间分别为24.1 h、26.1 h和25.4 h，克隆株QB-Tn-Ⅴ在EX-CELL420中的群体倍增时间为28.8 h。QB-Tn9-4s及其克隆株QB-Tn-Ⅰ和QB-Tn-Ⅴ在Sf-900Ⅲ中细胞最大密度分别是TNM-FH中的1.8、1.7和1.7倍，而在EX-CELL420中的细胞最大密度是TNM-FH中的0.9倍。
　　 AcMNPV感染各细胞的结果表明，克隆株QB-Tn-Ⅰ在Sf-900Ⅲ中的病毒感染率为80.3％，平均每个细胞病毒多角体（OBs）产量为33.9个，其他细胞的感染率均在90％以上，平均每个细胞多角体产量在81～87个之间，与对照细胞：BTI-Tn5B1-4的产量差异不显著。
　　 测定了各细胞在有血清培养基和无血清培养基中的重组蛋白表达水平，结果表明，克隆株QB-Tn-Ⅴ在Sf-900Ⅲ中第6 dβ-半乳糖苷酶的表达量最高（3.27×104IU/mL）；对比各细胞有血清和无血清培养下第6 dβ-半乳糖苷酶的表达量可以看出，各细胞在无血清培养基Sf-900Ⅲ中的表达量均高于在有血清培养基TNM-FH中的表达量，但克隆株QB-Tn-Ⅴ在无血清培养基EX-CELL420中的表达量低于其在Sf-900Ⅲ中和在有血清培养基TNM-FH中的表达量。BTI-Tn5B1-4在Sf-900Ⅲ中第7 d分泌型碱性磷酸酶的表达量（4.43 IU/mL）最高，其次为QB-Tn-Ⅴ（4.30 IU/mL）在Sf-900Ⅲ中的表达量。对比各细胞在有血清和无血清培养下第7 d的分泌型碱性磷酸酶表达量可以看出，各细胞在无血清培养基Sf-900Ⅲ中的表达量均显著高于有血清培养基TNM-FH中的表达量，但克隆株QB-Tn-Ⅴ在无血清培养基EX-CELL420中的表达量低于其在Sf-900Ⅲ中和有血清培养基TNM-FH中的表达量。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 昆虫细胞系的建立

1.1 昆虫细胞系建立的历史

1.2 昆虫细胞系建立的方法

2 昆虫细胞培养基

2.1 昆虫细胞培养基的发展

2.2 昆虫细胞无血清培养基

3 昆虫细胞系的应用

3.1 昆虫细胞在杀虫剂研究上的应用

3.2 昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产重组蛋白

3.3 其他方面的应用

4 细胞凋亡

4.1 细胞凋亡概述

4.2 细胞凋亡的特征

4.3 细胞凋亡的诱因

4.4 细胞凋亡的检测方法

5 研究的目的和意义

第二章 两种鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 棉铃虫胚胎细胞系的建立及生物学特性

3.2 粘虫胚胎细胞系的建立及生物学特性

4 讨论

4.1 昆虫细胞系的建立

4.2 细胞凋亡

4.3 细胞对病毒的敏感性

第三章 粉纹夜蛾胚胎细胞系QB-Tng-4s高蛋白表达克隆株的筛选及无血清驯化

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 QB-Tn9-14s细胞克隆及生物学特性

3.2 粉纹夜蛾胚胎细胞系QB-Tn9-4s及其克隆株的无血清驯化

4.讨论

4.1 细胞克隆

4.2 细胞的无血清驯化

4.3 病毒产量

4.4 蛋白表达

第四章 结论

参考文献

致谢

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