抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的变异

摘要

鸡新城疫（Newcastle disease，ND）是由一种Ⅰ型副黏病毒一鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引发的一种急性传染病。未经免疫的鸡群，传播性极强，发病和死亡率都非常高。即使一些已经多次免疫的鸡群，由NDV引发的急性和亚急性死亡仍不断零星发生，而由新城疫引起的呼吸道感染、亚临床感染及产蛋下降则更为普遍。七十年来，NDV一直是对鸡群危害最大的疫病。近十年中，国内禽病界一直试图在分子遗传水平阐明NDV毒株的变异趋势，在分子流行病学上已积累了大量毒株的资料和信息。但是，这些研究对信息的比较分析的深度还不够，缺乏对疫病控制方面最为关心的抗原性变异的相关性方面开展深入的研究。迄今为止，对病毒在免疫选择压作用下变异规律的研究还仅仅是根据从病禽收集到的病毒流行毒株来进行比较研究的，由于这些病毒之间的系谱关系不清楚，因此很难准确阐明在免疫选择压作用下病毒相关抗原表位相关碱基具体变异的规律。本试验首次尝试在严格的试验控制条件下显示抗体这一免疫选择压对NDV变异的影响。
　　 将NDV野毒株TZ060107接种10日龄SPF鸡胚后，取尿囊液以0.1％终浓度甲醛灭活，做成油乳剂灭活苗。免疫21日龄SPF鸡，2周后，加强免疫，二免后十天采集抗血清。通过这份血清的病毒中和试验，确定不完全抑制病毒复制的抗体最大浓度为1:50，用1:50作为加入到培养基中的抗体浓度，构成抗体免疫选择压。为了完成该试验，将已完成HN基因和F基因序列测定的原代病毒。TZ060107接种鸡胚成纤维细胞（CEF）连续传代，分为A组（培养基中含抗NDV的血清）和B组（培养基中无抗体），每组设3个独立的传代系列。分别对第10，20，30，40，50代病毒的HN基因和F基因进行扩增克隆测序。并将传代病毒的HN和F蛋白的氨基酸序列分别与原代病毒进行了比较，通过计算NS与S的比值，以显示抗体免疫选择压对NDV HN和F基因变异的影响。
　　 序列比较结果显示，有抗体A组HN基因发生突变的位点数明显多于无抗体B组，且非同义突变（NS）与同义突变（S）比值NS/S为6，明显高于无抗体B组NS/S的3.4。在有抗体A组有5个碱基位点发生稳定的非同义突变，而且其中三个（aa＃353，521和568）与已知的抗原表位密切相关。F基因在有抗体A组也出现2个稳定的非同义突变，无抗体B组没有产生稳定变异。但不论在有抗体A组还是无抗体B组，F基因变异的NS/S比均小于2.5。本研究表明，抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异，但对F基因变异的影响小于HN基因。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 引言

1.1 NDV的一般生物学特性

1.1.1 NDV的生物学活性

1.1.2 NDV的培养特性

1.1.3 NDV的致病特性

1.2 NDV的分子病原特性

1.2.1 NDV的基因结构

1.2.2 NDV的结构蛋白

1.3 NDV致病的分子基础

1.4 NDV的分子流行病学

1.4.1 ND四次大流行与基因型分类

1.4.2 国际NDV流行现状与基因型分析

1.4.3 国内ND流行趋势与基因分型研究现状

1.5 免疫选择压对病毒演化的影响

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.2 SPF鸡和鸡胚来源

2.1.3 主要试剂和仪器以及相关培养基和溶液的配置

2.1.4 引物

2.2 方法

2.2.1 鸡胚成纤维细胞的制备

2.2.2 病毒的处理

2.2.3 抗NDV单因子血清的制备及其效价的测定

2.2.4 病毒的传代

2.2.5 病毒RNA的提取

2.2.6 RT-PCR扩增NDV cDNA

2.2.7 PCR反应

2.2.8 凝胶回收DNA

2.2.9 PCR产物与T载体的连接

2.2.10 PCR产物的克隆

2.2.11 序列的测定

2.2.12 NDV HN和F基因序列比较分析

2.2.13 HI交叉抑制试验

3 结果与分析

3.1 培养基中不完全抑制NDV复制的最适血清浓度的确定

3.2 分子克隆结果

3.2.1 PCR结果

3.2.2 酶切验证

3.3 抗体选择压作用下HN基因和F基因的变异结果与分析

3.3.1 不同传代毒HN基因和F基因核苷酸序列稳定性

3.3.2 NDV在有抗体CEF传代的变异

3.3.3 NDV在无抗体CEF传代的变异

3.3.4 抗体对NDV传代过程中碱基突变的NS/S比值的影响

3.4 交叉HI结果及抗原同源性

4 讨论

4.1 抗体选择压作用下NDV HN基因的变异

4.2 抗体选择压作用下NDV F基因的变异

4.3 新城疫抗原性的变异

5 结论

6 参考文献

7 致谢

8 攻读学位期间发表论文情况