血管瘤型J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

摘要

禽白血病（avian leukosis，AL）是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病，可划分为A-J10个亚群。其中J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是由内源性和外源性ALV重组而来，自发现以来给养禽业造成了巨大的经济损失。一直以来，由于ALV病毒群的多样性、病毒自身的特殊性以及引起疾病的复杂性，对ALV防治的研究未见显著成效，至今无控制ALV感染的有效方法、药物和疫苗。
　　 J亚群白血病是由白血病病毒J亚群（ALV-J）引起的主要发生于肉种鸡的一种肿瘤性传染病，自1989年英国的Payne首次分离出ALV-J原型株HPRS-103以来，该病已迅速蔓延到世界各地，严重危害着养禽业的发展。近几年，我国数省26周龄左右的商品海兰褐蛋鸡爆发了血管瘤病，造成了巨大的经济损失。病鸡表现为衰竭、消瘦、在腿部、爪部、面部和翅下有大小不等的血疱。剖检可见内脏器官肿大，尤其是肝、脾表面及切面有大小不等的灰白色结节，内脏及体表血管瘤富有弹性，切开后流出大量的血液。
　　 为了解血管瘤爆发的原因，寻找防制对策，本研究对诱发血管瘤的病毒进行分离鉴定，通过接种DF1细胞、特异性单抗的间接荧光抗体反应（IFA）实验，从患病鸡群中分离鉴定出J亚群禽白血病病毒（ALV-J），并将此病毒命名为WS0705。从而确证此次爆发的血管瘤与J亚群白血病病毒密切相关。为明确该型病毒特性，用PCR方法扩增出gp85基因，并克隆进pMD18-T载体进行测序。氨基酸系统进化树分析显示：该血管瘤毒株（WS0705）与国外4个ALV-J毒株同源性为84.4％～97.6％；与国内来源于白羽肉鸡的8株ALV-J病毒同源性在89.9％～94.5％；与本实验室分离的两株ALV-J毒株的同源性为96.6％～97.4％。其中与ALV-J原型株HPRS-103的同源性最高，达到97.6％。系统进化树表明该血管瘤型J亚型禽白血病病毒不同于中国其它ALV-J病毒，与英国ALV-J原型株HPRS-103亲缘关系最近。
　　 为获得血管瘤型J亚群白血病毒gp85基因蛋白，为其快速精确诊断奠定基础，本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对WS0705gp85基因进行表达。从已构建的质粒pMD18-T-WS0705gp85中酶切回收gp85基因，构建重组转移载体pFastBacHTb-WS0705gp85。利用 Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-WS0705gp85。间接免疫荧光和Western blot检测WS0705gp85基因的表达产物。间接免疫荧光显示，构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞呈现明显的强阳性反应；Western blot分析，重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35kDa的阳性条带。结果表明，WS0705gp85基因在Sf9细胞中可以得到良好表达，且其编码产物完全可被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

符号说明

1 引言

1.1 禽白血病病毒的研究现状

1.1.1 J.亚群禽白血病

1.1.2 ALV-J的分子病毒学特性

1.1.3 ALV-J流行病学特点

1.1.4 ALV-J的诊断

1.1.5 ALV-J的防制

1.1.6 血管瘤型白血病

1.1.7 血管瘤白血病研究现状

1.1.8 血管瘤的病理变化

1.2 昆虫杆状病毒表达系统的研究进展

1.2.1 昆虫杆状病毒表达载体系统

1.2.2 研究进展

1.2.3 昆虫杆状病毒表达系统的分子基础

1.2.4 昆虫杆状病毒表达系统的应用

1.2.5 影响杆状病毒表达载体表达量的因素

1.2.6 昆虫杆状病毒表达系统的展望

2 材料与方法

2.1 材料来源及试剂

2.1.1 病例介绍

2.1.2 试验材料

2.1.3 Bac-To-Bac杆状病毒表达系统

2.1.4 试验地点

2.2 方法

2.2.1 病毒分离与增殖

2.2.2 间接免疫荧光反应

2.2.3 WS0705毒株前病毒DNA的抽提

2.2.4 PCR

2.2.5 重组质粒pMD18-T-WS0705gp85的构建

2.2.6 重组质粒pMD18-T-WS0705gp85的鉴定

2.2.7 WS0705gp85基因编码的氨基酸的同源性比较

2.2.8 重组转移载体的构建与鉴定

2.2.9 重组质粒的转座

2.2.10 重组BacmidDNA的提取及鉴定

2.2.11 重组Bacmid转染sf9昆虫细胞

2.2.12 重组杆状病毒的DNA的提取与鉴定

2.2.13 WS0705gp85在sf9昆虫细胞中的表达

2.2.14 重组杆状病毒在sf9昆虫细胞中的表达检测

3 结果

3.1 间接免疫荧光检测病毒

3.2 PCR

3.3 重组质粒的PCR及双酶切鉴定

3.4 WS0705gp85基因编码的氨基酸序列的同源性比较

3.5 重组转移载体的PCR及双酶切鉴定

3.6 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-WS0705gp85构建与鉴定

3.7 间接免疫荧光检测（IFA）

3.8 表达产物的SDS-PAGE及Western blot

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况