马铃薯Y病毒复制酶基因介导的病毒抗性研究

摘要

马铃薯Y病毒属是植物病毒中最大的一个属，包括马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）等，对世界范围内的经济作物造成的产量和经济损失严重。PVY存在着明显的株系分化现象，在寄主与病原相互作用中，且随着抗病品种等的应用，新的株系将会不断出现。RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance，RMVR）是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略，具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等优点。RNA介导的抗性也存在着一定的局限性，即抗性谱较窄，但这种局限性可以用同时表达多个不同的病毒RNA序列所弥补，所以可以把不同病毒的有效核酸片段连接起来转化植物，获得多抗植株。在前期的研究中，我们对CP基因在RNA水平上介导的病毒抗性进行了深入系统地研究，并且发现CP基因的3’端和5’端序列介导的病毒抗性存在显著差异。基于生产中存在的问题和本实验室的研究基础，本研究的第一个内容用马铃薯Y病毒的复制酶基因（nuclear inclusion b，NIb）的保守序列作为转基因材料，探讨核苷酸序列同源性与RNA介导的病毒抗性产生的关系，以及利用同源片段培育多抗病毒（株系）的可能性，研究结果为进一步阐明RNA介导基因沉默（病毒抗性）产生的机制，及利用该策略培育多抗病毒（株系）转基因植物提供依据。第二个内容是用马铃薯Y病毒NIb基因不同位置51bp长度片段构建反向重复转基因结构，探讨NIb基因不同位置的cDNA区段对RNA介导病毒抗性的影响，本研究结果对于有效地选择靶位点序列和成功应用RNA介导的病毒抗性策略，具有重大指导意义，研究结果和主要结论如下：
　　 根据已克隆的PVY-SD1 N Ib的全长cDNA序列（1557bp）序列设计了5段保守序列基因片段的特异引物，以PVY-SD1NIb的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到相应的基因扩增产物，双酶切纯化后，与用相同酶处理的pROKⅡ连接，热激法转化大肠杆菌DH5α，筛选并获得重组表达质粒PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ。酶切鉴定表明成功构建了植物表达载体。将成功构建的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR检测，结果表明，转化PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ分别获得168、150、166、155和170株T0代转基因植株。5种转基因烟草分别接种PVY3个分离物和TEV-SD1分离物后，发现：5个转基因株系PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ接种分离物PVY-SD1，转基因植株中抗性植株的比例分别为26.4％、22.6％、36％、20.2％和21.7％；接种分离物PVY-SD5，除了转基因株系PRIR-Ⅳ（84.3％）未获得抗性植株外，其余4个转基因株系（PR IR-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ）中抗性植株的比例分别为2.5％、3.0％、15.6％和4.3％；接种PVY-SD4和TEV-SD1则全部感病。结果显示：当转基因与病毒RNA序列间的同源性为100％-90.2％时，均可介导对病毒的抗性；同源性等于或低于88.2％时，则不能介导病毒抗性的产生。表明转基因与病毒RNA序列间高度的同源是抗性产生所必需的，最低同源性在90％左右。同时发现，抗性与同源性并不呈完全正相关。表明区段的位置或序列对RNA介导的病毒抗性产生也有影响。为了分析转基因的拷贝数与抗病性的关系，对获得的抗病转基因植株和部分感病转基因植株进行Southern杂交分析，结果表明，外源基因己整合到烟草基因组中，且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。转基因植株的Northern杂交分析表明，转基因都在RNA水平上得到了表达，抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株，抗性与RNA积累量呈负相关；抗病转基因植株中有siRNA存在，表明病毒抗性是由RNA介导的。
　　 根据已克隆的PVY-SD5 NIb的全长cDNA序列（1557bp）设计了5个不同位置，5'端（nt1-51）、5'端1/2（nt364-414）、中间（nt753-803）、3'端1/2（nt1143-1193）和3'端（nt1507-1557）基因片段的特异引物，以PVY-SD5 NIb的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到51bp的基因扩增产物。将扩增产物双酶切后，用T4DNA连接酶于16℃体外连接，热激法转化大肠杆菌DH5α。筛选并获得重组表达质粒pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ。酶切鉴定表明成功构建了植物表达载体。将成功构建的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草NC89。转化pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ的转基因植株经卡那霉素筛选和PCR检测，分别获得61、58、64、67和56株T0代转基因植株。转基因植株的抗病性分析表明：PVY NIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异，转pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ株系中，抗病植株的比例分别为31.15％、10.34％、51.56％、67.16％和16.07％。通过对转基因植株的Northern杂交分析表明，转基因都在RNA水平上得到了表达，抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株，抗性与RNA积累量呈负相关；抗病转基因植株中有siRNA存在，表明病毒抗性是由RNA介导的。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 引言

1.1 转基因沉默

1.1.1 转录后基因沉默在生物界的广泛性

1.1.2 转录后基因沉默的可传导性

1.1.3 转录后基因沉默的高特异性

1.2 RNA沉默涉及到的主要因子

1.2.1 dsRNA和siRNA

1.2.2 双链RNA特异性核酸内切酶（Dicer）

1.2.3 RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA Polymerase,RdRP）

1.2.4 RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）

1.3 RNA沉默的分子机理及其研究进展

1.3.1 RNA阈值模型

1.3.2 异常RNA模型

1.3.3 双链RNA模型

1.4 RNA介导的病毒抗性

1.4.1 RNA介导病毒抗性的特点

1.4.2 RNA介导的病毒抗性属于转录后基因沉默

1.4.3 hpRNA与RNA介导的病毒抗性

1.4.4 核酸序列同源性与RNA介导的病毒抗性

1.5 马铃薯Y病毒复制酶基因与抗病毒基因工程

1.6 本研究的立题依据和主要研究内容

1.6.1 立题依据

1.6.2 本研究主要研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

第一章 马铃薯Y病毒复制酶基因的保守序列介导的病毒抗性

3.1 PVY NIb基因保守序列的确定及同源性分析

3.2 目的片段的获得

3.3 重组表达载体的构建

3.4 植物表达载体的酶切鉴定

3.5 转化植株的获得

3.6 转化植株的PCR检测

3.7 转基因植株的抗病性分析

3.8 转基因植株Southern的杂交分析

3.9 转基因植株的Northern杂交分析

3.10 转基因植株siRNA的杂交分析

第二章 马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的抗性

3.11 目的片段的获得

3.12 目的片段的扩增和酶切

3.13 质粒DNA的酶切和回收

3.14 植物表达载体的构建

3.15 转化植株的获得

3.16 转化植株的PCR检测

3.17 转基因植株的抗病性分析

3.18 转基因烟草的Northern杂交分析

3.19 抗病烟草植株中siRNA的杂交分析

4 讨论

5 结论

6 参考文献

7 附录

8 致谢

9 攻读学位期间发表论文情况