马铃薯Y病毒CP基因介导抗性与转基因整合方式的关系及抗性传导

摘要

该研究的主要内容包括:利用已获得的转非翻译PVY CP(pPVYCPM)不同抗性的烟草,研究外源基因的整合方式与RNA介导病毒抗性的关系;通过不同抗性材料的嫁接试验,对RNA介导抗性的传导规律以及马铃薯Y病毒(PVY)的传播移动规律加以研究.具体结果如下:1.在转pPVYCPM基因烟草Southern blot分析时发现,同一转基因植株的基因组DNA用不同酶切时所得到的拷贝数不同,如用HindⅢ酶切时M4-1,M74-1,M84-1,M18-1的拷贝数分别为7,6,5,4;而用EcoRI酶切拷贝数分别为2,4,4,5.2.对转pPVYCPM基因的不同抗性转基因株系T<,1>代的研究表明,转基因的拷贝数与植株的抗病性有一定的联系.3.从已获得的转非翻译PVY CP基因烟草中选取高度抗病和感病株系各4份,对其T<,1>代植株分别进行卡那霉素抗性鉴定、PCR检测和PVY<'N>抗病性鉴定.4.高度抗病株系M13 T<,0>、T<,1>代卡那霉素抗性鉴定、抗病性鉴定和Southen blot分析表明,T<,1>代与T<,0>代相比,卡那霉素抗性和抗病性分离较小,分别为2.1﹪和6.2﹪.T<,1>代杂交带型和拷贝数有较大分离,但多数仍为多拷贝,表现高度抗病.5.单嫁接实验表明,PVY CP介导的抗病性并不能从高度抗病砧木传到上部转基因感病接穗或未转基因的接穗.6.双嫁接试验证明,PVY<'N>病毒可以跨越一段较长的(可达42cm)高度抗病植株的茎传递到未转基因的接穗中并引起症状,中部高度抗病植株不产生症状,ELISA检测为阴性.7.利用农杆菌渗入法对若干转pPVYCPM的感病株系的研究表明,瞬时表达并不能启动RNA介导的抗性机制,对抗性起决定作用的可能还是植物体内的转基因.

目录

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符号及缩略词说明

第一部分马铃薯Y病毒RNA介导抗性与转基因整合方式的关系及抗性传导规律

1引言

1.1转录后基因沉默

1.2转录后基因沉默与植物的RNA介导病毒抗性

1.3本研究的立论依据和主要研究内容

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1转非翻译PVY CP基因T1代植株的获得及鉴定

3.2转基因mRNA表达与抗病性的关系

3.3转基因整合方式与抗病性的关系

3.4高度抗病株系T1代抗病性表现的稳定性

3.5 RNA介导病毒抗性的传导

3.6农杆菌渗入法介导抗性

4讨论

4.1关于转基因的拷贝数

4.2转基因的拷贝数与RNA介导抗性

4.3转基因的整合方式与RNA介导抗性

4.4高度抗病株系T1代抗性及遗传稳定性

4.5 RNA介导抗性的传导

4.6病毒在RNA介导的高度抗病植株内的传送

4.7农杆菌渗入法介导病毒抗性

5结论

第二部分马铃薯X病毒25KD运动蛋白基因的克隆及表达载体的构建

1引言

1.1植物病毒运动蛋白的类型及作用机制

1.2植物病毒运动蛋白介导的抗病性

1.3植物病毒运动蛋白与转录后基因沉默

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1病毒RNA的提取

3.2 RT-PCR扩增PVX 25KD运动蛋白基因

3.3外源DNA与质粒载体的连接及重组质粒向大肠杆菌中的转化

3.4重组质粒的酶切鉴定

3.5 cDNA的序列测定

3.6植物表达载体的构建

4讨论与结论

参考文献

附录Ⅰ常用缓冲液及培养基的配制

附录Ⅱ常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器

附录Ⅲ质粒图谱

致谢

攻读学位期间发表论文情况