小菜蛾酚氧化酶原编码基因的分子克隆表达及其功能研究

摘要

酚氧化酶（phenoloxidase，EC.1.14.18.1，简称PO）广泛存在于动物、植物和微生物等生物体内，是昆虫体内的一种重要酶类，在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要作用，如（1）参与表皮的硬化和黑化：（2）对卵壳的鞣化作用；（3）参与伤害防御：（4）加速伤口的愈合等。本文通过RT-PCR和RACE技术，克隆得到了编码小菜蛾（Plutella xylostella）酚氧化酶原的两个基因Prophenoloxidase1（PxPPO1）和Prophenoloxidase2（PxPPO2）：并通过Semi-Quantitative RT-PCR和Quantitative Real-timePCR研究了PPO1和PPO2在小菜蛾不同发育时期的表达情况；同时使用两种典型的PO抑制剂-槲皮素和曲酸，对小菜蛾3龄幼虫进行了点滴处理，测定了处理后24h、48h和72h三个时间点PPO2的表达情况。研究结果如下：
　　 1.PxPPO1全长cDNA序列有2838 bp，包含一个2049 bp的开放阅读框（ORF），一个144 bp的5’非编码区（5’UTR）和一个645 bp的带有加尾信号的3'非编码区（3’UTR）。开放阅读框从第145个核苷酸开始，终止于第2193个核苷酸，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为682个氨基酸，分子量为78.56 kDa，估测等电点pI为6.43。PxPPO1的半衰期为30h，不稳定系数为42.01，化学分子式为C3468H5320N1000O1020S38。
　　 2.PxPPO2全长cDNA序列有2546 bp，包含一个2091 bp的开放阅读框（ORF），一个80 bp的5’非编码区（5’UTR）和一个375 bp的带有加尾信号的3’非编码区（3’UTR）。开放阅读框从第81个核苷酸开始，终止于第2171个核苷酸，由其推导的氨基酸序列也以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为696个氨基酸。PxPP02的分子量为79.86 kDa，估测等电点pI为6.44。PXPPO的体外半衰期为30h，不稳定系数为47.12，化学分子式为C3552H5459N1013O1046S24。
　　 3.氨基酸序列比对分析结果表明，PxPPO1基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPO1基因具有较高的同源性（70.5％～74.6％）：PxPPO2基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPO2基因也具有较高的同源性（72.2％～78.3％）。
　　 4.PxPPO1和PxPPO2各均具有两个高度保守的铜离子结合位点，及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基，此外，还包含一个类似于脊椎动物的α-巨球蛋白的硫羟酸酯区域。PxPPO1与PxPPO2的N端均不含信号肽，不存在跨膜结构域。
　　 5.PxPPO1中，α-螺旋占25.37％，随机卷曲占55.87％，它们是PxPPO1最大量的结构元件，延伸链占18.77％，散布在整个蛋白质中，无β转角存在；PxPPO2中，α-螺旋占24.57％，随机卷曲占58.91％，同样是最大量的结构元件，而延伸链占16.52％，散布在整个蛋白质中，无β转角存在。同源建模显示二者三级结构均为“α/β型”中的“滚筒结构”。
　　 6.PxPPO1在成虫中的表达量最低，设定为1.0，其在卵和4龄幼虫中表达量最高，分别为21.78和19.51：在1龄幼虫中表达量为6.44；在2龄、3龄和蛹中分别为15.76、14.09和16.88，较为接近。PxPPO2在成虫中的表达量较低，设定为1.0，其在卵和4龄幼虫中表达量最高，分别为22.34.和19.20；在1龄幼虫中表达量为0.86；在2龄和3龄幼虫中分别为13.03和15.36。
　　 7.在槲皮素和曲酸存在的条件下，PxPPO2的转录活性均得到不同程度的抑制。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验试虫饲养

2.2 试剂及仪器设备

2.3 小菜蛾总RNA的提取、鉴定及cDNA合成

2.4 小菜蛾酚氧化酶原基因1（PxPPO1）的克隆

2.5 小菜蛾酚氧化酶原基因2（PxPPO2）的克隆

2.6 基因序列的生物信息学分析

2.7 小菜蛾不同发育时期两种酚氧化酶的表达研究

2.8 槲皮素/曲酸处理后小菜蛾PxPPO2的表达研究

3 结果与分析

3.1 小菜蛾总RNA的提取

3.2 小菜蛾酚氧化酶原基因1（PxPPO1）的克隆

3.3小菜蛾酚氧化酶原基因2（PxPPO2）的克隆

3.4 小菜蛾PPO基因序列的生物信息学分析

3.5 小菜蛾不同发育时期两种酚氧化酶的表达研究

3.6 槲皮素/曲酸处理后小菜蛾PxPPO2的表达研究

4 讨论

4.1 小菜蛾PPO基因序列的生物信息学分析

4.2 小菜蛾不同发育时期两种酚氧化酶的表达研究

4.3 槲皮素/曲酸处理后小菜蛾PxPPO2的表达研究

4.4 本研究下一步拟开展的工作

5 结论

6 参考文献

7 附录

8 致谢

9 攻读学位期间发表论文情况