限制性内切酶介导玉米弯孢霉叶斑病病菌转化体系的建立

摘要

玉米弯孢霉叶斑病（Curvularuia leaf spot of corn）是玉米上的一种重要的叶部病害，流行年份造成严重的经济损失。该病害是由新月弯孢（Curvularia lunata）等弯孢霉属真菌引起的，了解该病原菌的致病分子机理对其病害的有效防治具有重要意义。
　　 本研究对玉米弯孢霉叶斑病病菌的原生质制备条件进行了优化。结果表明，玉米弯孢霉叶斑病菌体的培养时间、细胞壁降解酶的种类与配比、酶解时间、以及再生稳渗剂等一系列因素对原生质体释放及再生有明显的影响。根据研究结果总结出玉米弯孢霉叶斑病原生质体制备方法：即（1）从PDA固体培养基上培养10d的菌落上洗下病菌的分生孢子；（2）将孢子按浓度106个/mL接种到改良Fries液体培养基中，28℃下振荡培养24h，过滤洗涤收集菌丝；（3）用10㎎/mL溶壁酶、10㎎/mL崩溃酶和10㎎/mL蜗牛酶组成的混合酶在30℃，150r/min的条件下酶解6h；（4）将酶解好的原生质体的酶解溶液用3层擦镜纸过滤；（5）用已灭菌的0.7 mol/L山梨醇溶液冲洗，将冲洗液在4000r/min，4℃条件下离心10min，弃上清，再用STC洗涤2次后得到所需浓度的原生质体。
　　 本研究以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒（pUCATPH）利用限制酶介导整合转化（restriction enzyme-mediated integration，REMI）玉米弯孢霉叶斑病菌野生菌株WD-1，共获得了165个转化子。将这些转化菌株于PDA上培养3代，发现所有转化子各子代均能在含200μg/mL潮霉素的PDA培养基上生长，而野生菌株WD-1不能生长，说明转化子在遗传上是稳定的。对这些突变体的基因组进行了PCR扩增，发现所有参试基因组中都能扩增检测到潮霉素磷酸转移酶基因（hph）序列。经对所选取的5个转化子进行生长速度和产孢量测定，发现4个转化子的产孢量低于野生菌株WD-1，有1个转化子的产孢量较野生菌株WD-1升高。对所选取的转化子在PDA上生长速度进行测定，结果发现4个转化子的生长速度和野生菌株相比有所减慢。
　　 Brn1基因（1，3，8-三羟基萘还原酶基因）是与黑色素合成相关的重要基因。关于其致病性的研究，本文根据同源重组原理，以质粒pUCATPH为基础构建了带有潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因的载体pUC-JB，以REMI介导的转化手段转化玉米弯孢霉叶斑病病菌原生质体，共获得29个遗传稳定的转化子。通过PCR验证没有得到真正的突变体。
　　 启动子与绿色荧光蛋白（gfp）融合表达实验表明：基因在Curvularialunata的营养菌丝、分生孢子中均表达，其中孢子中荧光强度稍弱。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略表

1.引言

1.1 玉米弯孢霉叶斑病病情现状

1.2 病原生物学特征

1.3 弯孢菌黑色素致病基因的研究

1.4 玉米弯孢霉叶斑病病菌遗传转化方法的研究途径

1.4.1 CaCl2/PEG介导的原生质体（Protoplasts/PEG）转化法

1.4.2 电穿孔（Electroporation）转化法

1.4.3 醋酸锂（Lithium Acetate）转化法

1.4.4 转座子标签技术（Transposon tagging）

1.4.5 脂质体（Liposome）转化法

1.4.6 基因枪（Biolistics）转化法

1.4.7 激光（Laser）诱导融合法

1.4.8 限制性内切酶介导整合（REMI）突变

1.4.9 农杆菌介导突变（ATMT）

1.5 本研究目的和意义

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试菌

2.1.2 试剂和药品

2.1.3 仪器和设备

2.1.4 供试培养基

2.1.5 溶液的配制

2.2 实验操作

2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.2 质粒pUCATPH的DNA的小量提取

2.2.3 质粒pUCATPH的线性化

2.2.4 菌落生长抑制浓度的筛选

2.2.5 原生质体制备方法

2.2.6 REMI转化及转化子潮霉素抗性的稳定性检测

2.2.7 Bm1基因的克隆

2.2.8 突变载体的构建

2.2.9 原生质体制备和REMI转化

2.2.10 转化子和突变体的筛选

3.结果与分析

3.1 质粒的提取

3.2 原生质体制备及纯化条件的确定

3.2.1 菌龄对原生质体制备的影响

3.2.2 孢子培养液的选择及过滤菌丝操作

3.2.3 酶的种类及浓度

3.2.4 酶解时间对原生质体制备的影响

3.2.5 玉米弯孢霉叶斑病的病菌原生质体的获得

3.2.6 原生质体的纯化

3.2.7 原生质体的再生

3.2.8 潮霉素对玉米弯孢霉叶斑病菌的抑制浓度

3.3 REMI遗传转化与转化子的获得

3.4 突变体的检测

3.4.1 突变体插入稳定性检测

3.4.2 PCR验证

3.5 突变体的生物学性状观察测定结果

3.5.1 突变菌株生长速度的测定

3.5.2 突变菌株产孢量的测定

3.5.3 转化子分生孢子的显微特征比较

3.6 Brn1基因的克隆

3.7 重组载体验证结果

3.8 突变子的获得

3.9 基因同源重组转化子筛选

4.讨论

4.1 原生质体的制备与再生

4.1.1 菌体培养时间

4.1.2 酶解时间

4.1.3 酶系统

4.1.4 稳渗剂

4.1.5 再生方式

4.2 玉米孢霉叶斑病菌的REMI诱变

4.3 Brn1基因的克隆

4.4 有待进一步研究的问题

5.结论

参考文献

致谢