鸡胚胎性疫病病原检测和禽波氏杆菌OMPA原核表达及免疫原性检测

摘要

禽波氏杆菌病是由禽波氏杆菌引起的一种禽的高度接触性传染病，由于该菌既能水平传播又能垂直传播，所以在家禽传代过程中，该病不断得以放大，给家禽造成更大的危害。本研究对山东省某三个大型肉种鸡场的764枚死亡鸡胚进行病毒性及细菌性的病原检测。采用核酸探针技术及ALV-p27检测试剂盒方法对几种主要病毒进行检测，结合传统的细菌检测方法和23S Rrna基因克隆测序的方法检测几种主要病原菌。从而确定死亡鸡胚中病毒与病原菌的多重感染情况。发现由禽波氏杆菌感染引起的鸡胚死亡占有较大的比重，约占23.56％。近年来禽波氏杆菌病的广泛存在已给养禽业带来较大的经济损失。目前没有特效疫苗，致使该病得不到合理有效的防治。本研究对实验室已有的禽波氏杆菌进行23S Rrna基因克隆测序，确定其与从死亡鸡胚中的新分离株（LL、XT株）的同源性为99.2％～99.7％。对新分离株（LL株）的外膜蛋白A（OMPA）进行克隆测序，确定其与AM167904株禽波氏杆菌的核苷酸序列同源性为77.1％，氨基酸序列同源性为83.2％。将OMPA进行原核表达，纯化后的蛋白免疫4周龄Babl/c小鼠并检测抗体效价。为筛选禽波氏杆菌外膜蛋白中的有效免疫成分用于研制禽波氏杆菌外膜蛋白亚单位疫苗具有重要意义。
　　 第一部分：规模化肉种鸡场胚胎性疾病的多重感染及鸡胚病原菌多重PCR检测方法的建立。对山东某三个大型肉种鸡场17～19日龄的死亡鸡胚进行细菌分离鉴定，经形态特性、生化特性、血清学试验及23S Rrna测序分析，分析确定细菌种属，并统计不同病原菌之间的多重感染比率，经核酸探针技术及ALV-p27检测试剂盒进行ALV、REV和CIAV的检测并对其之间的多重感染比率进行统计。发现导致鸡胚死亡的病原菌主要为禽波氏杆菌（23.56％），大肠杆菌(46.47％)，沙门氏菌(56.28％)，绿脓杆菌(45.18％)，葡萄球菌(15.71％)，且相互之间的二重感染、三重感染、四重感染的合计比率分别为35.34％、26.18％、0.65％。禽波氏杆菌与其他病原菌间的二重感染、三重感染、四重感染比率分别达到7.84％、13.08％和6.54％。导致鸡胚死亡的主要病毒因素ALV、REV和CIAV的感染比率分别为13.00％、20.00％和23.00％，其二重感染、三重感染的比率合计分别为11.00％和2.00％，禽波氏杆菌与这三种病毒间的二重感染、三重感染和四重感染比率分别为15.00％、6.00％和1.00％。根据禽波氏杆菌的OMPA基因、沙门氏菌invA基因、大肠杆菌phoA基因和绿脓杆菌toxR基因序列各设计了1对特异性引物，用于这几种主要病原菌的多重PCR方法的快速准确检测。为相关病原菌的快速检测提供了有效依据。
　　 第二部分：禽波氏杆菌分离株的23S Rrna进化分析。对已有的波氏杆菌进行23S r RNA基因的测序分析，发现以前保存的8株禽波氏杆菌与新分离株（LL、XT株）之间核苷酸序列同源性为99.2％～99.7％，与GenBank中收录的NC_010645株禽波氏杆菌核苷酸序列同源性为92.4％ ～92.5％，与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的核苷酸序列同源性均为98.5％ ～ 99.2％。国内分离的禽波氏杆菌菌株和支气管败血波氏杆菌菌株均与国外分离菌株在遗传基因上有一定的差异，并且23S Rrna序列分析可以作为鉴定禽波氏杆菌的一种快速简便的方法。
　　 第三部分：禽波氏杆菌外膜蛋白A(OMPA)免疫原性检测。对禽波氏杆菌（LL株）的外膜蛋白OMPA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。禽波氏杆菌OMPA基因全长597 bp，编码199个氨基酸。将禽波氏杆菌OMPA基因片段克隆到PGEX4T-3表达载体中，转化至E.coli BL21(DE3)感受态进行诱导表达，将纯化的蛋白免疫4周龄Babl/c小鼠并检测抗体效价。以纯化的重组蛋白OMPA包板，检测抗体效价最高为5.4，并不能起到免疫保护作用。这一结论为进一步筛选禽波氏杆菌外膜蛋白亚单位疫苗提供了参考依据。

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1 引 言

2 材料与方法

3 结果与分析

结 论

参考文献

个 人 简 介

致 谢

攻读硕士学位期间发表的论文