低温胁迫下甜椒CBF3基因的表达和功能研究

摘要

在自然界中，植物不可避免地遭受各种环境因子的胁迫，其中低温是一个重要的环境因子,它在很大程度上影响了植物的生长发育、生存及分布，是限制农作物的地理分布和造成产量与品质下降的重要因素之一。因此植物的抗寒机理以及提高植物抗寒性一直是植物抗逆性研究中的一个热点。在长期的进化过程中植物形成了响应低温和提高低温抗性的机制。植物感受低温信号之后，启动防御机制，包括物理结构适应（质膜组成改变和细胞骨架重排）、胞内渗透保护物质（可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等）含量增加、抗氧化剂的合成水平上升（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸酶等）、低温诱导蛋白（如抗冻蛋白、脱水蛋白、热激蛋白等）的合成等等，使植物体内建立新的物质和能量代谢平衡，从而在低温环境下存活。由CBF 类转录因子介导的低温信号和抗性机制在植物抵抗低温胁迫中发挥了重要作用，也是目前了解最清楚的一条植物响应低温的信号转导通路。CBF 类转录因子受低温瞬时诱导，并且该诱导不依赖于ABA。CBF 作为转录激活因子特异性的识别并结合启动子中的CRT/DRE 顺式作用元件，激活启动子中含有CRT/DRE 元件的胁迫响应基因的表达，从而提高植物的低温抗性。CBF 类转录因子在多种植物中被发现，并且超表达其中的某个成员能够显著提高转基因植株的低温抗性，同时对其它非生物胁迫（盐胁迫、渗透胁迫等）的抗性也有所提高。
　　 当植物遭受温度胁迫时，生物膜是伤害的初始位点。植物体膜脂中不饱和脂肪酸含量越高，膜脂相变温度就越低，低温抗性就越强。反之，则相变温度越高，高温抗性越强。本研究中发现，低温胁迫下转基因烟草植株中不饱和脂肪酸的含量明显高于野生型植株。甜椒（Capsicum frutescens L.）是一种重要的茄果类调味品，因其果实营养丰富，特别是维生素C 含量为各种蔬菜之冠深受到人们的喜爱。因此研究甜椒响应低温的机理，提高其低温抗性具有重要的理论和应用价值。克隆得到了甜椒中的CBF3基因，对其表达模式和功能进行了分析：
　　 （1）利用同源序列设计简并引物，先通过RT-PCR的方法从甜椒叶片克隆到CBF3基因的中间片段，然后采用RACE的方法分别克隆到5 ′片段和3 ′片段，拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。
　　 （2）将p35S-CfCBF3-GFP 融合蛋白在洋葱表皮中瞬时表达。通过Confocal 观察到CfCBF3-GFP 特异性的定位于细胞核中，而GFP 则在细胞中的各个组分中都能够被检测到。说明CfCBF3基因产物定位于细胞核，符合转录因子的特征。
　　 （3）Northern 杂交分析表明，CfCBF3基因在叶片组织中表达量较高。同时该基因的表达受低温、盐、干旱等胁迫诱导，其表达水平随胁迫处理时间的延长而变化。
　　 （4）将获得的CfCBF3基因与含有35S 启动子的pBI121 载体重组，构建表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转入烟草中，通过5‰的卡那霉素筛选，获得了转基因植株。
　　 用PCR、Northern及Western 杂交的方法对带卡那抗性的转基因烟草植株进一步检测，结果证明目的基因已经整合到部分转基因苗的基因组中，成功地获得了转基因植株。
　　 （5）构建了原核表达载体pET-CfCBF3，并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白，将强诱导带切下，溶于PBS 获得抗原，免疫BALB/c小鼠，制备抗体，其抗血清效价为1:500。
　　 Western 杂交表明，转基因植株中CfCBF3 已在蛋白水平过量表达。另外分别对低温和干旱处理的野生型甜椒进行了Western 杂交分析。结果表明，CfCBF3 在蛋白水平的表达与转录水平基本一致，转录后即刻翻译成蛋白。
　　 （6）甜椒CBF3基因在烟草中的超表达激活了其下游响应基因ERD10B，ERD10C以及P5CS的表达。P5CS是脯氨酸合成途径中的关键酶，酶活性的变化直接决定着脯氨酸合成量的多少。正常条件下，转基因烟草中脯氨酸的含量与野生型植株相比均已升高，这极有可能与P5CS基因的高表达相关。研究表明，逆境下脯氨酸积累的多少可以作为植物抗逆性强弱的生理指标，此外，脯氨酸还在防止酶变性、能量储备、自由基清除等方面起重要作用。ERD10B和ERD10C 作为CBF基因的下游基因，在转基因植株中，表达量升高，表明CfCBF3是作为一个转录因子在起作用的。
　　 （7）转基因植株与野生型植株相比具有较强的抗冷性。不同胁迫处理后，转基因植株比野生型的生长量高，生长状态好。DAB及NBT染色实验结果表明，低温处理后，野生型烟草中的叶片颜色明显加深，斑点增多，而转基因植株的叶片颜色只有轻微的改变。此外，H2O2和O2 含量测定的数据结果与染色实验相一致，这进一步证明了野生型植株中H2O2和O2 积累量明显高于转基因植株。这表明过表达CfCBF3 提高了烟草抗低温能力。
　　 (8）测定了转基因株系NT5、NT27、NT38和野生型植株叶片中各膜脂成分的相对含量及其脂肪酸组成，并且计算出了野生型与转基因烟草中不饱和脂肪酸的相对含量。
　　 经过12h 低温处理后，与野生型植株相比，转基因植株中叶绿体的主要的类脂单半乳糖基甘油二酯（MGDG）、双半乳糖基甘油二酯（DGDG）、硫代异鼠李糖基甘油二酯（SQDG）、磷脂酰胆碱（PC）和PE中不饱和脂肪酸含量均有所升高，而在磷脂酰甘油（PG）中升高更加明显。NT5，NT27及NT38 不饱和脂肪酸含量分别从32.41,41.94及39.84提高至61.15,70.46及74.86％，而野生型植株变化很小，从43.11％至43.24％。转基因植株中脂肪酸不饱和度升高。低温（0 ℃）胁迫条件下处理12h后，植株相对电导率升高，但是野生型植株比转基因植株增加的幅度大；低温胁迫24h后，转基因株系与野生型叶片的Fv/Fm 均明显下降，转基因株系下降幅度小，NT5，NT27，NT38和WT的Fv/Fm分别降低了10.7％、11.9％，9.5％和20.5％，这意味着CfCBF3的过表达减轻了PSII的光抑制程度，转基因烟草PSII 反应中心受伤害较轻，提高了转基因植株的低温抗性。
　　 （9）利用酵母双杂交技术试图找出甜椒CBF基因在低温应答途径中的相互作用的蛋白。

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