国内禽戊型肝炎病毒的分离鉴定及其抗原性的研究

摘要

禽戊型肝炎病毒（HEV）是鸡的大肝大脾（BLS）病或肝炎脾大（HS）综合症的主要病原，主要引起30-72周龄的蛋鸡和肉种鸡的死淘率升高和产蛋率下降（20-40％），发病鸡通常腹部充血，卵巢退化，肝脏脂肪或淀粉样变性，偶有肝脾肿大。该病曾给澳大利亚的养禽业造成了严重的经济损失，而我国也时有该病爆发的报道。
　　 禽HEV 与人、猪HEV 同属于肝炎病毒属，为无囊膜，单股正链RNA 病毒，其基因组全长约为6.6kb，比哺乳动物HEV基因组全长少600bp左右，包含5'帽子和3' PolyA结构，含有3个开放阅读框（ORF），分别为ORF1、ORF2和ORF3。其中ORF2基因编码衣壳蛋白是病毒的主要结构蛋白，并且包含病毒主要的抗原表位。由于禽HEV 没有合适有效的体外培养系统，因此对该病毒的研究大多主要集中在病毒的亚单位蛋白ORF2上，通过原核或真核表达该蛋白，了解该蛋白的生物学活性和抗原性等，从而为该病毒的诊断和预防等提供材料和理论支持。
　　 1.国内禽HEV的RT-PCR 检测。根据实验室前期的禽HEV的血清学调查结果，从山东部分的禽HEV抗体阳性率较高的鸡场，收集患有BLS病或HS综合症病鸡的粪便、胆汁和血清。然后参考国外研究学者设计的禽HEV 检测引物，对收集样品中的禽HEV RNA 进行RT-PCR 检测。
　　 结果从山东某肉种鸡场收集的粪便和胆汁样品中检测到禽HEV ORF2部分序列，通过该段序列与国外参考序列的同源性比较发现，与欧洲部分国家的分离株同源性较高。
　　 2.国内禽HEV分离株的全基因组序列分析。参考GenBank上已知禽HEV的全基因组序列，设计12对引物。利用RT-nest-PCR方法从禽HEV核酸检测阳性的胆汁中，扩增六段相互重叠的禽HEV的基因组片段，然后通过软件拼接获得首个国内禽HEV分离株的全基因组序列，命名为CaHEV。将CaHEV 与已知参考的4个禽HEV 全基因组序列进行同源性和进化树分析，结果发现CaHEV与欧洲同源性最高，同属于禽HEV基因3型。并且不同禽HEV基因型的ORF2之间，氨基酸同源性达到97％以上，提示禽HEV可能仅存在单一的血清型。
　　 3.CaHEV的致病性研究。将含有禽HEV的胆汁翅静脉攻毒1周龄的SPF 鸡，对病毒进行增殖，然后用GE方法对病毒悬液进行定量。利用定量的CaHEV 病毒悬液，通过口腔和翅静脉两种途径分别攻毒15周龄的SPF鸡，每组26只。攻毒后每天收集粪样，每三天收集血清，每周剖杀两只鸡，直到第12周剖杀所有鸡只，收集剖杀鸡只的胆汁，肝脏和脾脏同时观察剖杀鸡只的肝脏和脾脏的肉眼损害以及其病理学变化。通过对收集样品的RT-PCR检测发现，翅静脉攻毒组，攻毒后第3天就能从粪便中检测到病毒，一直持续到攻毒后54天仍能检测到；第6天开始出现病毒血症，约持续到第21天左右；口腔攻毒组，在攻毒后第6天开始粪便排毒，第62天仍然排毒，病毒血症开始出现在第12天，持续到第33天。通过ELISA检测攻毒鸡的禽HEV抗体发现，翅静脉攻毒组，抗体效价迅速达到高峰后就开始消退，而口腔接种组缓慢达到高峰并维持一段时间。另外，两种途径接种均有只2 只鸡出现了肝脾肿大和严重的出血坏死，脏器的病理学变化也都符合HS 综合症的部分临床症状，实验进一步论证了禽HEV 可能是HS 综合症的主要病原，但并不是唯一原因。
　　 4.禽HEV抗体检测的间接ELISA方法的建立及应用。利用大肠杆菌原核表达禽HEV 衣壳蛋白C 端268个氨基酸，纯化后获得蛋白ORF2-268，将该蛋白作为包被抗原，摸索优化ELISA条件，建立禽HEV血清学诊断的间接ELISA方法。利用该ELISA方法，调查了山东省11个种鸡场的禽HEV感染情况。结果发现11个种鸡场都有过禽HEV的感染，不同鸡场的血清阳性率差异显著。其中有两个鸡场的阳性率达到了77％左右，而在检测的所有1379 份血清中,493 份阳性，阳性率也达到了35.8％，说明禽HEV的感染在山东省某些种鸡场已经非常严重，而且该病的感染已在全省范围内广泛流行。
　　 此外，利用该ELISA 方法，跟踪检测了某种鸡场5个不同厂区的不同周龄鸡的禽HEV抗体的阳性率，结果发现，5个厂区都在12周龄左右就检测到了禽HEV抗体，在20-30周龄时，抗体阳性率达到最大，其中某个厂区在40-50周龄时出现了第二个高峰，大于60周龄时，抗体阳性率非常低。结果说明禽HEV在该种鸡场自然状况下的感染通常发生在小于10周龄的鸡，当鸡只达到20-30周龄时，禽HEV感染了鸡场里大多数的鸡，当达到60周龄时，禽HEV抗体已经在大多数鸡中消退。
　　 5.禽HEV人工感染鸡后产生的针对不同抗原区的抗体变化规律禽HEV的衣壳蛋白含有病毒主要的抗原表位，并且通过软件分析和前期实验室的研究发现，衣壳蛋白的前半段22-83aa 存在着一个主要的抗原区，而在后半段有339-383aa,389-410aa,461-492aa，556-566aa和583-600aa 5个主要的抗原区，另外ORF3蛋白上也存在着抗原表位能够刺激机体产生免疫反应。为了研究这几个抗原区在人工感染鸡中产生的免疫应答情况，利用实验室前期表达的不同的截段蛋白ORF2-F（包含22-83aa），ORF2-S（包含后半段5个主要的抗原区），ORF2-5（339-442aa，包含后半段前两个抗原区），ORF2-8（383-515aa，包含后半段第2和第3个抗原区），ORF2-9（412-546aa，包含第4个抗原区）和ORF3蛋白作为包被抗原，间接ELISA 检测了禽HEV 感染鸡后不同日龄的血清中针对不同抗原区的抗体变化规律。结果发现针对ORF2-S蛋白的抗体在感染后12天左右就可以检测到，比ORF2-F和ORF3的早约3天左右，但是针对ORF2-F和ORF3的抗体效价迅速达到高峰后（感染后21天左右）就开始消退，而针对ORF2-S的则缓慢达到高峰维持一段时间后，缓慢消退。用ORF2-5 作为包被抗原检测的抗体效价变化规律与用ORF2-S的相似，而用ORF2-8 作为包被抗原的则测得抗体效价很低，说明人工感染禽HEV的鸡主要产生了针对抗原区339-383aa的抗原应答反应。当用ORF2-9 作为包被抗原时，检测不到任何针对该蛋白的抗体，说明人工感染禽HEV的鸡并没有对该区域412-546aa产生免疫应答反应。
　　 6.禽HEV病毒样粒子的获得利用杆状病毒真核表达系统，表达了禽HEV衣壳蛋白全长，N端缺失56个氨基酸的ORF2Δ56和C端268个氨基酸的ORF2-268蛋白。通过IFA和Western-blot鉴定发现，三段蛋白都在该系统中成功表达，并且发现ORF2Δ56蛋白表达后分泌到细胞培养上清中。同时将该系统表达的三段蛋白与原核表达的相同氨基酸序列的蛋白分析发现，该系统除了表达获得预期大小的蛋白外，还获得了多个比预期大小小的蛋白，证实了禽HEV衣壳蛋白在该系统中表达可能被细胞内的酶酶解成小的片段。另外，通过对分泌到细胞上清中的ORF2Δ56蛋白蔗糖密度梯度离心纯化，负染透射电镜观察，发现禽HEV衣壳蛋白的片段ORF2Δ56蛋白在sf9昆虫细胞中表达后可以自我组装成病毒样粒子。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

1 前言

2 我国鸡群禽HEV的RT-PCR 检测

3 国内禽HEV 分离株的全基因组序列分析

4 国内禽HEV 分离株CaHEV的致病性研究

5 禽HEV抗体检测的间接ELISA的建立及应用

6 禽HEV衣壳蛋白昆虫细胞的表达及其病毒样粒子的获得

结论

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表论文