枸杞多糖对雷公藤多苷致SD大鼠雄性生殖损伤的干预研究

摘要

目的：
　　研究枸杞多糖与雷公藤多苷含药血清对SD大鼠睾丸细胞增殖率及SCF、C-kit、Caspase-3表达的影响；研究枸杞多糖对雷公藤多苷所致SD幼鼠雄性生殖损伤的干预途径。
　　方法：
　　1.细胞培养将成年雄性SD大鼠随机分为3组，分别给予双蒸水0.5ml·100g-1(空白组)、雷公藤多苷片0.9mg·100g-1(GTW组)、枸杞多糖16mg·100g-1和雷公藤多苷片0.9mg·100g-1(混合药物组)每日1次灌胃，连续1周。于末次灌胃2h后麻醉，心脏采血，制备含药血清。主要用胰蛋白酶和胶原酶二步消化法分离并提取10天内新生SD大鼠睾丸细胞进行原代培养。将细胞分为4组，分别是空白组、GTW组、混合药物组及FBS组，MTT法观察相应含药血清干预24h、48h后各组细胞增殖率，免疫细胞化学法检测干预24h后各组细胞SCF、C-kit、Caspase-3表达。
　　2.动物实验将3周龄雄性SD大鼠随机分为3组，分别给予双蒸水0.5ml·100g-1(空白组)、雷公藤多苷片0.9mg·100g-1(GTW组)、枸杞多糖16mg·100g-1和雷公藤多苷片0.9mg·100g-1(混合药物组)每日1次灌胃，连续8周。末次灌胃2h后，每组随机各取8只大鼠，处死，摘取睾丸，Bouin液固定睾丸；光镜下观察睾丸组织形态学改变；免疫组织化学法检测Bax、Bcl-2表达；原位末端标记法检测生精细胞凋亡。将剩余所有大鼠分笼喂养，按照雌雄1：1比例配对，15天后取出雄性大鼠，继续饲养雌鼠至产仔，记录配对雌鼠受孕、产仔情况。
　　结果：
　　1.细胞培养实验结果
　　1.1细胞的生长增殖24h、48h各组活细胞反应的OD值组间比较均有显著性差异(p<0.05)；混合药物组OD值均显著高于GTW组(p<0.05)，而与空白组比较，差异没有统计学意义(p>0.05)。
　　1.2SCF的表达混合药物组明显高于GTW组，差异有统计学意义(p<0.05)；GTW组明显低于空白组、FBS组，差异比较有统计学意义(p<0.05)；混合药物组、空白组及FBS组三组比较，呈增高趋势，没有显著的统计学差异(p>0.05)。
　　1.3C-kit的表达各组间比较差异有统计学意义(p<0.05)；混合药物组表达显著高于GTW组、FBS组，差异比较有统计学意义(p<0.05)，与空白组比较差异没有统计学意义(p>0.05)。
　　1.4Caspase-3的表达各组间比较差异较显著(p<0.05)；GTW组的表达明显高于其它3组(p<0.05)；混合药物组与FBS组比较有统计学意义(p<0.05)，与空白组比较差异无统计学意义(p>0.05)。
　　2.动物实验结果
　　2.1睾丸组织形态学改变光镜下可见，与空白组比较，GTW组大鼠睾丸组织生精上皮变薄，生精细胞数量减少，排列紊乱，部分生精小管腔内空虚，可见发育成熟的精子但排列紊乱，有较大的空隙；混合药物组大鼠曲细精管内各级生精细胞排列略稀疏，支持细胞胞质略萎缩，可见发育成熟的精子。
　　2.2睾丸组织Bax的表达各组间比较差异具有统计学意义(p<0.05)；GTW组的表达显著高于其余两组(p<0.05)；混合药物组的表达较空白组显著增高(p<0.05)。
　　2.3睾丸组织Bcl-2的表达各组间比较差异无统计学意义(p>0.05)；表达强度从高到低依次为GTW组、混合药物组、空白组。
　　2.4睾丸组织生精细胞凋亡各组间比较差异具有统计学意义(p<0.05)；空白组大鼠的睾丸组织内仅有极少量生精细胞凋亡，为正常生理状态下凋亡的生精细胞；GTW组大鼠睾丸组织内出现较多凋亡的生精细胞，表达强度显著高于正常组(p<0.05)；混合药物组同样可以看到凋亡的生精细胞，表达强度上明显低于GTW组(p<0.05)。
　　2.5生育力结果各组间比较差异无统计学意义(p>0.05)；空白组、GTW组雌鼠受孕率高于混合药物组；平均产仔个数，GTW组较空白组减少，混合药物组较GTW组增多。
　　结论：
　　1.雷公藤多苷对雄性有生殖损伤，推测其机制是通过抑制生精细胞增殖、下调生精细胞中SCF与C-kit表达来实现的；
　　2.枸杞多糖可以抑制雷公藤多苷的生殖损伤作用，其作用途径是促进雷公藤多苷引起的SCF与C-kit低表达以及生精细胞凋亡的修复。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

实验一 枸杞多糖对雷公藤多苷致雄性生殖损伤的干预之细胞培养材料与方法

1.材料

1.1实验动物

1.2药品与试剂

1.3主要实验仪器

2.方法

2.1制备含药血清

2.2睾丸细胞的原代提取与培养

2.3MTT法检测大鼠睾丸细胞增殖率

2.4免疫细胞化学法检测大鼠睾丸细胞中SCF、C-kit、Caspase-3的表达

2.5统计学处理

结果

1.细胞形态学观察

2.各组大鼠睾丸细胞的增殖率

3.各组大鼠睾丸细胞SCF的表达

4.各组大鼠睾丸细胞C-kit的表达

5.各组大鼠睾丸细胞Caspase-3的表达

讨论

结论

第二部分 枸杞多糖对雷公藤多苷致雄性生殖损伤的干预之动物实验材料与方法

1.材料

1.1实验动物

1.2药品与试剂

1.3主要实验仪器

2.方法

2.1分组与给药

2.2组织的处理

2.3载玻片的处理

2.4 HE染色观察大鼠睾丸形态学改变

2.5免疫组织化学法检测大鼠睾丸Bax、Bcl-2表达

2.6 Tunel法检测大鼠睾丸细胞凋亡

2.7生育力结果

2.8统计学处理

结果

1.各组睾丸组织形态学改变

2.各组大鼠睾丸Bax的表达

3.各组大鼠睾丸Bcl-2的表达

4.各组大鼠睾丸生精细胞凋亡情况

5.各组大鼠生育力情况

讨论

结论

总结

细胞照片

参考文献

文献综述:雷公藤多苷致雄性生殖损伤及中药增效减毒研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

个人简历