农杆菌介导的杜鹃花遗传转化体系的建立

摘要

杜鹃花是我国十大传统名花之一，具有极高的观赏价值，近年来在国内外花卉市场上十分走俏。杜鹃花耐寒性强(可耐-39.4℃低温)，但其嗜酸忌盐的特性是栽培利用的最大限制因素。现已证明液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX1基因，是植物抗盐机制中的核心因子，具有抗盐、调节pH值、改变花色的三重功能，已成功用于多种植物的抗盐育种。本研究以映红杜鹃叶片为外植体，对芽再生体系进行了详细的研究；同时采用基因工程的手段将由拟南芥(Arabidopsisthaliana)cDNA中扩增出的Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1转入到映红杜鹃中，并对其遗传转化体系进行了系统研究，以期获得抗盐耐碱的杜鹃花转化系，为杜鹃花耐碱育种提供种质资源，并且为工厂化育苗奠定基础。
　　 本实验以映红杜鹃愈伤组织为受体材料，首先利用农杆菌介导法将AtNHX1基因导入映红杜鹃基因组中，同时对影响映红杜鹃转化效率的多个因素做了进一步的探讨，建立了映红杜鹃遗传转化体系；然后对抗性植株进行RT-PCR检测证明AtNHX1成功转入映红杜鹃中。本研究的主要研究结果如下：
　　 1、映红杜鹃芽再生体系的建立：以无菌苗叶片为外植体，1/4Anderson培养基为基本培养基，诱导愈伤组织最佳培养基为1/4Anderson+2，4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L；芽诱导最佳培养基为1/4Anderson+IBA0.1mg/L+TDZ1mg/L；生根培养基为1/4Anderson+IAA2mg/L+NAA0.1mg/L。
　　 2、实验测试了卡那霉素对愈伤组织的影响，结果表明：映红杜鹃愈伤组织对卡那霉素非常敏感，以Kan50mg/L作为最适筛选压。
　　 3、抑菌剂头孢霉素的浓度为500mg/L时，能完全抑制农杆菌的生长，同时对愈伤组织的再生影响最小。
　　 4、通过对农杆菌介导的遗传转化研究，探讨了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、As浓度对农杆菌T-DNA转化效率的影响，实验结果表明：愈伤组织预培养5d转化效率最高，抗性愈伤组织频率达19％；农杆菌菌液浓度为OD600=0.5时愈伤组织侵染效率最高；最适合愈伤组织侵染的时间为20min；共培养2d对愈伤组织转化效果最好；共培养培养基添加浓度为20mg/L的As能显著提高转化效率。
　　 5、利用优化的转化受体系统，将Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1成功转入映红杜鹃基因组中，获得了21株抗性植株。经过RT-PCR检测证明将AtNHX1成功转入映红杜鹃基因组中的有4株。
　　 6、转基因杜鹃花株系抗盐性测定：转基因杜鹃花株系，在含盐量为2g/L的培养基上长势最好，存活率可达90%；在含盐量为4mg/L、6mg/L的培养基上，植株萎蔫或死亡。