抑制第二次减数分裂恢复和氧化应激对小鼠卵母细胞排卵后老化的调控作用

摘要

停滞在MⅡ期的哺乳动物卵母细胞随着在输卵管或培养液中停留时间的延长而发生老化。老化会导致孤雌激活率和碎裂率的升高,MPF活性降低,皮质颗粒、纺锤体等细胞器分布和组装异常,卵母细胞受精率下降以及受精后胚胎发育能力下降。许多研究和临床应用的实验设计都涉及成熟卵母细胞在显微操作和授精前的体外培养。因此有必要采取合适的方法对卵母细胞老化进行调控。本文通过抑制第二次减数分裂恢复和氧化应激来调控小鼠卵母细胞排卵后老化。系统研究了MG132,咖啡因以及半胱胺和胱氨酸在不同温度下对小鼠卵母细胞体外老化的调控作用,明确了它们在不同温度下对小鼠卵母细胞老化的抑制情况以及恢复后胚胎体外发育能力的影响。研究了在15℃处理后对卵母细胞纺锤体形态,皮质颗粒分布及Bcl-2蛋白水平的影响。本文同时也初步研究了冈田酸对小鼠卵母细胞体外老化的抑制作用,证实了卵丘在冈田酸抑制老化过程中的作用。实验结果如下:
　　1、低温可以抑制卵母细胞的老化。从不加试剂处理的对照组可以看出,在37℃时,6小时孤雌激活率就升高,在25℃时,能维持12小时孤雌激活率不升高,在15℃时,能维持48小时孤雌激活率不升高。
　　2、MG132在不同温度下,对卵母细胞老化的抑制情况不同。当在37℃老化6小时后,2μM、2.5μM、3μM和3.5μM MG132都能有效抑制卵母细胞的老化,其中3μM和3.5μM MG132抑制卵母细胞6小时恢复后的囊胚率和在37℃老化6小时的对照组囊胚率没有显著差异。在37℃作用12小时时,尽管1μM、2μM和4μM MG132都能有效抑制卵母细胞的老化,但是恢复后的囊胚率都很低,不能维持卵母细胞的发育能力。在25℃时,尽管1μM、2μM和4μM MG132都能有效抑制卵母细胞的老化,但是恢复后的囊胚率都比37℃老化6小时的对照组的囊胚率低。在15℃时,1μM、2μM和4μM MG132都能有效抑制卵母细胞的老化。当卵母细胞在15℃保存12小时,在37℃恢复6小时后,1μM和2μM MG132的囊胚率与37℃老化6小时的对照组囊胚率没有显著差异,但是4μM的MG132恢复后的囊胚率显著低于37℃老化6小时的对照组囊胚率。当卵母细胞在15℃保存24小时恢复6小时后,各个浓度MG132实验组的囊胚率都低于37℃老化6小时对照组的囊胚率。
　　3、在15℃时,1μM MG132处理卵母细胞12小时及24小时恢复前后的纺锤体形态和皮质颗粒排布及Bcl-2蛋白水平的检测结果表明,在恢复前,卵母细胞没有形成完整的纺锤体形态,当恢复后几乎均形成完整的正常尖头纺锤体形态。皮质颗粒的染色结果表明,在12小时恢复前,皮质颗粒多以早迁移的方式存在,恢复后皮质颗粒排布正常。在24小时恢复前,皮质颗粒主要以早迁移和晚迁移的方式存在,恢复后皮质颗粒主要以正常形态存在,但是仍低于对照组。Bcl-2蛋白水平染色结果表明,当卵母细胞保存12小时恢复前后,Bcl-2蛋白水平都很高,但是当保存24小时恢复前后,Bcl-2蛋白水平降低。
　　4、在不同温度下,咖啡因对卵母细胞老化的抑制情况不同。在37℃老化6小时时,8mM、10mM和12mM咖啡因都能有效抑制卵母细胞的老化。但是仅8mM咖啡因抑制卵母细胞老化恢复后的囊胚率和在37℃老化6小时的对照组囊胚率没有显著差异。在37℃作用12小时时,4mM、6mM和8mM咖啡因都能有效抑制卵母细胞的老化。但是恢复后的发育能力都很低。在25℃时,咖啡因不能很好的抑制卵母细胞的老化,而且随着咖啡因浓度的升高,卵母细胞死亡严重。在15℃时,2mM和4mM咖啡因可以有效抑制卵母细胞老化,但是不能维持卵母细胞的发育能力。
　　5、半胱胺和胱氨酸组合可以抑制卵母细胞的老化。在37℃老化6小时时,150μM半胱胺和300μM胱氨酸既能有效抑制卵母细胞老化,恢复后又能维持卵母细胞的发育能力。在37℃老化12小时时,尽管半胱胺和胱氨酸可以有效抑制卵母细胞的老化,但恢复后不能维持卵母细胞的发育能力。在25℃时,100μM半胱胺和200μM胱氨酸以及150μM半胱胺和300μM胱氨酸不仅能抑制卵母细胞的老化,而且作用12小时恢复后,其发育能力与37℃老化6小时的对照组的囊胚率没有显著差异。在15℃时,100μM半胱胺和200μM胱氨酸不仅能有效抑制卵母细胞的老化,而且作用24小时恢复后,能维持卵母细胞的发育能力。说明抗氧化剂能维持卵母细胞的发育能力,加入 Vc的实验也验证了这一结论。但是当卵母细胞在15℃保存36小时恢复后,各个浓度实验组的囊胚率都低于37℃老化6小时对照组的囊胚率。
　　6、在15℃时,200μM Vc处理卵母细胞12小时及24小时恢复前后以及100μM半胱胺和200μM胱氨酸处理卵母细胞24小时及36小时恢复前后的纺锤体形态和皮质颗粒排布及Bcl-2蛋白水平的检测结果表明,在恢复前,没有形成完整的纺锤体形态,当恢复后几乎均形成完整的正常纺锤体形态。对皮质颗粒的染色结果表明,200μM Vc处理卵母细胞12小时恢复前,皮质颗粒多以早迁移的方式存在,恢复后,皮质颗粒排布恢复正常。200μM Vc处理卵母细胞24小时恢复前,皮质颗粒主要以早迁移和晚迁移的方式存在,恢复后,皮质颗粒主要以正常形态存在,但是仍低于对照组。100μM半胱胺和200μM胱氨酸处理卵母细胞24小时恢复前,皮质颗粒多以早迁移和晚迁移的方式存在,恢复后皮质颗粒分布正常;处理36小时恢复前,皮质颗粒主要以晚迁移的方式存在,恢复后皮质颗粒主要以正常形态存在,但是仍低于对照组。Bcl-2蛋白水平染色结果表明,当200μM Vc处理卵母细胞12小时以及100μM半胱胺和200μM胱氨酸处理卵母细胞24小时恢复前后,Bcl-2蛋白水平都很高,但是当200μM Vc处理卵母细胞24小时以及100μM半胱胺和200μM胱氨酸处理36小时恢复前后,Bcl-2蛋白水平降低。
　　7、在37℃时,2μM MG132联合10.27mM丙酮酸以及100μM半胱胺和200μM胱氨酸,处理卵母细胞9小时恢复后能维持卵母细胞的发育能力;在15℃时,100μM半胱胺和200μM胱氨酸联合10.27mM丙酮酸,处理卵母细胞48小时恢复后能维持卵母细胞的发育能力。
　　8、在不含能量物质的CZB中,冈田酸抑制卵母细胞老化的过程中,卵丘细胞起到了阻碍卵母细胞老化的作用。

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1前言

1.1卵母细胞老化引起的危害

1.2卵母细胞老化过程中超微结构的变化

1.2.1线粒体

1.3老化卵母细胞孤雌激活率的变化

1.4老化卵母细胞的钙离子波动

1.5卵母细胞老化与细胞凋亡

1.6低温对卵母细胞的影响

1.7卵母细胞老化的调节

1.8本文的研究目的和意义

2材料与方法

2.1主要试剂及配制

2.2实验动物及超排处理

2.3体内成熟卵母细胞的获取

2.4裸卵的制备

2.5卵母细胞体外老化处理

2.6乙醇结合6-DMAP激活

2.7 SrCl2激活处理

2.8胚胎培养

2.9皮质颗粒染色

2.10卵母细胞纺锤体（α－微管蛋白）染色

2.11 Bcl-2蛋白染色

2.12激光扫描共聚焦显微术

2.13实验设计

2.14数据统计分析

3结果与分析

3.1不同温度下MG132抑制卵母细胞老化所需要的浓度

3.2不同温度下MG132处理卵母细胞恢复后的发育情况

3.2.1 37℃时MG132处理卵母细胞恢复后的发育

3.3 MG132 对卵母细胞纺锤体形态和皮质颗粒分布以及 Bcl-2 蛋白水平的

3.4不同温度下咖啡因抑制卵母细胞老化所需要的浓度

3.5不同温度下咖啡因处理卵母细胞恢复后的发育情况

3.6不同温度下半胱胺和胱氨酸抑制卵母细胞老化所需要的浓度

3.7不同温度下半胱胺和胱氨酸处理卵母细胞恢复后的发育情况

3.8抗氧化剂对卵母细胞纺锤体形态和皮质颗粒分布以及Bcl-2蛋白水平的

3.9半胱胺和胱氨酸结合其他老化抑制剂处理卵母细胞恢复后的发育情况

3.10冈田酸对排卵后卵母细胞体外老化的调控

3.11卵丘细胞在冈田酸抑制卵母细胞老化过程中的作用

4讨论

4.1培养液的选择

4.2选择COC作为实验的模型

4.3 OA对卵母细胞老化的调控

4.4低温对卵母细胞老化的抑制作用

4.5 MG132处理后对卵母细胞老化的影响

4.6咖啡因处理后对卵母细胞老化的影响

4.7抗氧化剂对小鼠卵母细胞老化的调控

4.8 15℃时抑制卵母细胞老化对纺锤体形态和皮质颗粒分布以及Bcl-2蛋白水平的影响

5结论

参考文献

附录

致谢

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