一氧化氮调控桃果实山梨醇脱氢酶活性的分子机理

摘要

桃果实的品质主要取决于糖酸、香气、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等要素，其中糖酸组分、糖酸含量及糖酸比对果实内在品质的形成有着重要的影响，是决定果实风味的重要指标。本文以肥城桃为试材，研究了一氧化氮(NO)对果实体内可溶性糖及相关酶活性的影响，探讨了高效液相色谱-蒸发光检测(HPLC-ELSD)方法分离山梨醇、果糖、葡萄糖和蔗糖的混合物的条件，并克隆表达山梨醇脱氢酶重组蛋白，利用表达的重组蛋白进行酶动力学试验，结合定点突变技术和圆二色光谱分析，研究了NO对SDH空间构象的影响，进而提出NO抑制山梨醇脱氢酶活性的分子机理。
　　 研究发现：10μmolL-1NO处理显著抑制了桃果实贮藏后期可溶性糖含量的增加和果实糖酸比的变化，有效延缓了果实中糖类物质相互之间的转化，尤其保持了蔗糖相对较高的含量和相对较低的果糖、葡萄糖的含量，显著提高了贮藏期间桃果实山梨醇脱氢酶和山梨醇氧化酶的活性，提高了蔗糖磷酸合成酶的活性，对转化酶(酸性转化酶和中性转化酶)和蔗糖合成酶相关酶活的抑制作用有时间效应。
　　 四种糖的混合物利用岛津高效液相色谱仪分离。色谱柱：Phenomenex Luna 5u NH2 100A column(250mm×4.60mm，5micron)(Agilent，USA)；流动相：乙腈-水(82.5:17.5，V/V)；流速：1mLmin-1；柱温：30℃；进样量：20μL。检测器：蒸发光检测器380-LC(Varian，USA)；漂移管温度82℃；载气为氮气；载气流速为2Lmin-1。在以上条件下，四种糖组分均能很好的分离，相关系数R=0.9965-0.9999。LODs(S/N=3)和LOQs(S/N=10)分别为0.0008～0.0047μg和0.0020μg～0.0118μg。回收率96.05％～103.32％。RSD(％)为0.28％～2.06％。
　　 实时荧光定量PCR试验表明，花后60d的基因表达量是花后30d的5.1倍，花后90d是花后30d的16.5倍。克隆的目的基因与已报道的序列相似度达到100％，Escherichia Coli表达的重组SDH蛋白经Ni-NTA柱纯化后具有山梨醇脱氢酶的催化功能。重组SDH催化反应的最适条件：温度35℃，pH9.0,山梨醇浓度0.20mol·L-1，Km=0.6667mol·L-1。研究发现，SDH的荧光强度随着NO浓度的增加而降低；圆二色谱分析结果表明，经NO处理之后，208nm、218nm和222nm处的吸光度分别降低了14.6％～28.0％、19.8％～35.7％和12.0％～42.2％。
　　 本文研究发现，SDH在最适反应条件下其活性明显受到NO抑制。NO对SDH的抑制类型通过SDH氧化山梨醇的最初反应速率确定，属于非竞争性抑制，抑制常数Ki=17.5μmol·L-1，并对NO抑制SDH活性的分子机理进行了讨论。