Wolbachia在重叶榕小蜂中的感染格局和wsp基因的进化

摘要

榕树-榕小蜂是典型的协同进化系统，是研究物种形成，种群遗传与动态，适应性进化，共生体系协调稳定机制的理想材料。榕果（隐头花序）是榕小蜂生存的场所。垂叶榕果是多花层的，生态位丰富，小蜂物种多样。果内小蜂存在共取食和寄生关系，生态关系非常密切。果腔狭小，雄虫打斗激烈，存在多种交配和打斗机制。与此同时，榕果提供一个密闭的系统，榕小蜂从受精卵到成虫的发育过程完全在榕果内进行，只有很少的机会与外界接触，这与自然界中绝大多数的昆虫与植物都处于开放或半开放系统中不同。紧密的生态学关系，相对隔绝的生存环境使垂叶榕果成为一个独特而理想的实验材料。
　　 Wolbachia作为一种内共生菌，具有生殖调控作用，一般认为是垂直传播的母系遗传。它感染约上百万种昆虫，其感染的广泛性和引起的作用不容忽视。之前的研究发现膜翅目有较高的Wolbachia感染率，而榕小蜂更是如此。那么垂叶榕果内小蜂Wolbachia的感染状况是怎样的呢?特殊的密闭榕果环境中，是否与开放环境中Wolbachia的感染格局不同?系统内是否因为紧密的生态学联系有更多的水平传播现象?Wolbachia是如何传入密闭榕果环境的?Wolbachia感染与宿主所处的密闭环境和紧密的生态学关系相结合，使这些问题变得十分有趣。
　　 通过对垂叶榕果内4科、8属、17种、870头小蜂个体的Wolbachia感染状况研究发现:1）垂叶榕密闭榕果系统内榕小蜂Wolbachia感染率很高;2）果内榕小蜂感染wsp序列具有高重组现象;3）Wolbachia在果内多水平传播;4）结合垂叶榕小蜂生态学和水平传播状况的研究，我们发现广泛存在的非重组序列由果外传入，而有翅型雄性与雌虫的果外交配是可能的传入途径。
　　 在垂叶榕小蜂Wolbachia感染研究中发现，榕果内不同的物种感染状态是不同的。有的物种感染单一wsp序列，浓度高，种内感染率高;有的物种感染多种wsp序列，浓度低，种内感染率适中或较低，这就形成了两种极端不同的感染模式。不同感染模式形成的原因十分值得思考。Wolbachia感染格局（包括浓度、株系、感染率）的形成，不仅与Wolbachia株系本身特点有关，还与感染的宿主，及宿主的生存环境有关。之前关于感染状态的研究，大多集中在感染率，感染株系及株系传播途径的推断上，很少从宿主角度对感染格局的形成原因进行研究。本研究从宿主系统发生，物种形成时间，宿主群落特点等方面对Wolbachia感染格局的形成进行分析，帮助我们全面深入了解榕小蜂Wolbachia的感染格局。
　　 经过垂叶榕小蜂感染调查，我们发现了两种典型的感染格局，即高浓度、单株系、高感染率格局和低浓度、多株系和低感染率格局。为了深入了解这种感染格局形成的原因，我们选取了垂叶榕Acophila，Walkerella，Sycoscapter和它们的近缘物种进行研究。又联合本实验室之前在中国榕小蜂DNA条形码研究中偶然扩增的Wolbachia的coxA在宿主中的分布情况分析发现:1)亲缘关系近，感染状态不一定相似，感染具有一定的随机性;2）物种形成年代久远，易形成高浓度单株系的稳定感染，例如造瘿小蜂物种间分化时间长，一旦感染易形成单一株系感染;3）物种形成事件频繁的寄生性榕小蜂，对于多株系感染的忍耐力强，一旦感染容易形成多株系、低浓度感染格局;4）雌雄异株小蜂因为更多的近缘交配，更大的窝数，更低的性比，更少的有翅雄蜂种类，利于形成Wolbachia单一株系、高浓度、高感染率的稳定感染状态。本部分研究，有助于我们理解小蜂感染格局的形成原因，预测小蜂的感染状况，寻找Wolbachia与宿主相互作用的实验材料组，进行下一步试验。
　　 榕小蜂有很高的物种丰富度，总量很大，近缘种也很多，姊妹种和隐存种现象较为多见。榕小蜂具有高的Wolbachia感染率，对宿主具有生殖调控作用，尤其是其双向胞质不亲和作用，很可能导致物种的形成。那么，某些榕小蜂活跃的物种形成是否与Wolbachia有关呢?确定物种形成的因素十分复杂，我们不能轻易下结论。但是我们首次选取了同域共存的，系统发育关系最为相近的垂叶榕传粉榕小蜂，检测它们的Wolbachia感染状态，用以探索共生榕小蜂物种形成的可能线索。或可能寻找形态分化的选择压力。
　　 经过垂叶榕传粉小蜂线粒体coI和核基因ITS2序列建树比较发现，1）垂叶榕传粉榕小蜂共有4个种，1个海南地理种，3个云南同域共存种;2）联合该属近缘物种建树发现，这4个物种聚在一起，不与其它榕树小蜂物种混合，说明在现有的分子数据下，这4个物种没有发现寄主转移;3）云南3个物种可以在同批次收蜂中找到，说明这3个物种可以同域共存;4）4个物种中除了海南物种感染特有的wben-3，云南物种没有与系统发育对应的wsp感染状态;5）感染个体和不感染个体能共享相同的线粒体单体型;6）四种传粉榕小蜂线粒体基因均偏离中性选择;7）海南和云南地域物种的分化时间大概是500-600万年前。垂叶榕上的四种传粉小蜂是否由同域物种形成， Wolbachia是否在其中起关键作用我们目前还不得知，下一步工作将对四个物种的形态分化和Wolbachia感染株系进行深入而细致研究。

目录

声明

符号说明

论文说明

摘要

1 前言

1．1 Wolbachia研究概述

1．1．1 Wolbachia分类和分布

1．1．2 Wolbachia株系鉴定方法

1．1．3 Wolbachia基因组研究现状

1．1．4 Wolbachia传播方式：垂直传播和水平传播

1．1．5 Wolbachia与宿主的相互作用

1．1．6 同种或近缘宿主Wolbachia的感染研究

1．1．7 体系内多物种Wolbachia的感染研究

1．1．8 Wolbachia与物种形成

1．1．9 Wolbachia的应用研究

1．2 榕树研究概述

1．2．1 榕树的分类学

1．2．2 榕树的分布

1．2．3 雌雄同株与雌雄异株

1．2．4 榕树的发育时期

1．2．5 榕树与外界生物

1．3 榕小蜂概述

1．3．1 传粉榕小蜂概述

1．3．2 非传粉榕小蜂概述

1．3．3 榕小蜂的寄生关系

1．3．4 榕小蜂与榕树的共进化

1．3．5 榕小蜂物种的形成

1．3．6 榕小蜂雄性多型和雄性有翅现象

1．4 垂叶榕小蜂背景研究

1．4．1 垂叶榕分类及生态学

1．4．2 垂叶榕小蜂的种群动态

1．4．3 垂叶榕传粉小蜂的主动传粉

1．4．4 垂叶榕小蜂中雄性有翅现象

1．4．5 垂叶榕小蜂产卵时序

1．5 立题依据

1．5．1 密闭垂叶榕果内榕小蜂Wolbachia的感染研究

1．5．2 榕小蜂属内近缘种或近缘属Wolbachia的感染格局研究

1．5．3 垂叶榕传粉榕小蜂共存现象及形态分化

2 材料与方法

2．1 榕小蜂收集与鉴定

2．2 DNA的提取

2．3 PCR扩增和测序

2．4 序列分析

2．4．1 重组序列的发现

2．4．2 系统发育分析

3 结果与分析

3．1 垂叶榕密闭榕果中榕小蜂Wolbachia的感染研究

3．1．1 垂叶榕小蜂具有高Wolbachia感染率

3．1．2 垂叶榕小蜂系统内wsp序列多样

3．1．3 Wolbachia在垂叶榕小蜂系统内的分布情况

3．2 榕小蜂近缘属Wolbachia感染研究

3．2．1 Acophila属系统发育与Wolbachia感染

3．2．2 Otitesellinae亚科的Wolbachia感染

3．2．3 Sycoscapter属系统发育与Wolbachia感染

3．3 垂叶榕传粉小蜂物种形成与Wolbachia感染

3．3．1 垂叶榕传粉小蜂Wolbachia感染检测

3．3．2 垂叶榕传粉小蜂线粒体coI基因检测

3．3．3 垂叶榕传粉小蜂核基因ITS2检测

3．3．4 垂叶榕传粉小蜂物种与批次的关系

3．3．5 垂叶榕小蜂形态鉴定

4 讨论

4．1 垂叶榕果内小蜂感染状况的研究

4．1．1 wsp基因在榕果内发生高频的重组事件

4．1．2 wsp基因的转移能否代表Wolbachia的转移?

4．1．3 垂叶榕小蜂系统内Wolbachia广泛的水平传播

4．1．4 垂叶榕小蜂系统Wolbachia的感染起源

4．1．5 wsp序列共存对垂叶榕小蜂生态关系的推断

4．2 榕小蜂近缘种Wolbachia感染格局调查与比较分析

4．2．1 榕小蜂物种形成时间与Wolbachia感染格局

4．2．2 雌雄同株异株榕小蜂Wolbachia的感染格局

4．2．3 感染格局与榕小蜂生态

4．3 垂叶榕传粉榕小蜂物种形成分析

4．3．1 Wolbachia感染与物种形成

4．3．2 垂叶榕小蜂的系统发育关系

4．3．3 垂叶榕传粉榕小蜂同域共存及形态比较

5 结论

参考文献

7 附录

附录一 垂叶榕小蜂wsp序列

附录二 垂叶榕传粉榕小蜂coI

附录三 垂叶榕传粉榕小蜂ITS2

附录四 垂叶榕传粉榕小蜂wsp序列

附录五 本试验获得的其它小蜂物种coI基因

附录六 本试验获得的其它小蜂ITS2序列

致谢

9 攻读学位期间发表论文情况

博士学位论文内容简介及自评