利用CytoTrap酵母双杂交方法筛选与PRDM1、PRDM14有相互作用的蛋白

摘要

目的：锌指蛋白转录抑制因子1和14（Prdm1、Prdm14）是PRDM家族中的两个成员，在原始生殖细胞(primordialgermcell,PGC)的特化过程中具有重要作用。PRDM1能抑制体细胞分化基因表达；PRDM14不但可以调控PGC的特化而且使其具有诱导多能性。Blimp1（Prdm1）缺失的小鼠只能形成少数的PGC样细胞，同时失去了迁移特性、增值和抑制HOX基因的功能；Prdm14缺失突变的小鼠，Sox2表达量下降，PGC细胞没有发生基因组表观遗传重编程现象。所以，寻找那些与PRDM1、PRDM14有相互作用的蛋白并研究它们之间的作用机制，将对深入了解PRDM1、PRDM14的功能及它们信号传导途径具有重要意义。本课题主旨在于使用CytoTrap酵母双杂交方法从人脾cDNA文库筛分别选出与PRDM1、PRDM14有相互作用的蛋白，为进一步研究二者的功能、调控机制以及信号传导途径提供新的思路和理论依据。
　　方法：构建Psos-hPRDM-Flag和Psos-hPRDM14-Flag两种重组质粒，摸索了制备酵母cdc25H(α)感受态细胞的最佳条件并获得了大量cdc25H(α)感受态细胞，通过梯度实验确定诱饵基因和文库质粒共转的使用量。利用CytoTrap酵母双杂交筛库的方法，分别以Psos-hPRDM1-Flag重组质粒、Psos-hPRDM14-Flag重组质粒为诱饵从人脾脏cDNA文库中筛选出与其能够发生相互作用的蛋白。
　　结果：利用CytoTrap酵母双杂交系统从人脾脏文库中成功地筛选出了13种蛋白可能与hPRDM1有相互作用，22种蛋白可能与hPRDM14有相互作用。
　　结论：成功构建Psos-hPrdm1-Flag和Psos-h Prdm14-Flag两种重组质粒并利用CytoTrap酵母双杂交系统有效地筛选出与之互作的蛋白，为研究hPRDM1和hPRDM14提供了新的切入点。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

材料与方法

1.主要仪器和设备

2．主要材料与试剂

3.目的片段特异性扩增引物

4.测序引物见表2

5.溶液配制

6. hPrdm1、hPrdm14酵母双杂交诱饵质粒的构建

7.筛选与pSos-hPRDM1、pSos-hPRDM14互作的蛋白

结果

1． hPrdm1、hPrdm14 PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，增片段分别约为2100 bp、1780bp，与预测大小相符

2. 双酶切鉴定pSos-hPrdm1、pSos hPrdm14质粒，与预测大小相符

3. 测序结果显示，两个质粒者序列100%与设计序列相吻合。

4. 人脾cDNA文库滴度及文库扩增结果检测

5．表型验证结果

6.诱饵自激活及Sos基因完整性检测

7．诱饵蛋白在酵母中表达检测

8．文库筛选几个阶段结果

讨论

结论

参考文献

综述:PRDM1、PRDM14与原始生殖细胞特化

致谢

攻读学位期间发表的学术论

个人简历