CytoTrap酵母双杂交系统筛选突触后致密物质-93与CX3CL1相互作用位点

摘要

目的:筛选突触后致密物质-93(PSD-93)与趋化因子CX3 CL1相互作用位点.方法:对诱饵基因PSD-93(1-852aa)进行全基因合成,PCR扩增CX3CL1(1-395aa)诱饵基因全长和PSD-93-mut1(1-192aa)、PSD-93-mut2(1-420aa)、PSD-93-mut3(1-535aa)、PSD-93-mut4(1-661aa)及CX3CL1-mut(25-357aa)文库基因,并将PSD-93和CX3 CL1基因重组入pSos载体,构建全长诱饵质粒pSos-PSD-93和pSos-CX3 CL1;PSD-93-mut1、PSD-93-mut2、PSD-93-mut3、PSD-93-mut4、CX3 CL1-mut基因被重组入pMyr载体,构建突变体质粒pMyr-PSD-93-mut1、pMyr-PSD-93-mut2、pMyr-PSD-93-mut3、pMyr-PSD-93-mut4、pMyr-CX3 CL1-mut.经酶切及测序鉴定构建质粒正确后将其转化酵母菌cdc25 Hα,检测其在酵母中的表达、有无自激活作用及细胞质定位,并利用CytoTrap酵母双杂交系统筛选PSD-93与CX3 CL1蛋白相互作用位点.结果:成功获得重组诱饵质粒和突变体质粒,在酵母双杂交系统中,通过将构建的质粒进行两两结合,筛选出以下阳性克隆:全长质粒pSos-PSD-93+全长质粒pMyr-CX3CL1,全长质粒pSos-CX3CL1+pMyr-PSD-93-mut3,全长质粒pSos-CX3CL1+pMyr-PSD-93-mut4,从而鉴定出PSD-93和CX3CL1结合的具体氨基酸序列.结论:在本实验条件下,PSD-93和CX3 CL1的结合位点分别位于PSD-93的420-535 aa序列和CX3 CL1的357-395 aa序列.