葡萄糖抑制小鼠卵母细胞老化的机理及小鼠卵母细胞的体外保存

摘要

第一部分：哺乳动物卵母细胞排卵后停留于输卵管内，若不及时受精就会发生老化。老化将影响卵母细胞受精后的胚胎发育。老化卵母细胞受精后出生的小鼠出现明显的神经敏感和情绪异常以及生殖能力下降和寿命缩短等现象。与在输卵管内滞留相似，卵母细胞在体外培养也发生老化。然而，许多动物(包括人类)可能在发情周期中的任何一段时间进行交配，很容易导致老化的卵母细胞发生受精。另外，在许多临床治疗及胚胎工程研究(如体细胞核移植及人工辅助生殖)中，卵母细胞往往要先培养一段时间，再进行授精或者显微操作，也有可能导致卵母细胞的老化。例如，要保证体细胞克隆的成功，受核胞质的细胞周期必须严格控制；如果用老化卵母细胞作为受核胞质，细胞融合率和核移植胚胎的发育率将会显著降低。因此，研究卵母细胞老化的机制及调控，对于哺乳动物的健康生殖及胚胎工程技术发展都至关重要。
　　 有研究表明，体外培养液中能量物质组成的轻微变化对卵母细胞减数分裂成熟产生巨大影响。例如，去除培养液中的葡萄糖，卵泡刺激素(FSH)不能诱导卵母细胞减数分裂恢复。在无葡萄糖条件下，毫摩尔级的丙酮酸能够克服由次黄嘌呤或双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)引起的减数分裂阻滞。另外，FSH能够激活卵丘-卵母细胞复合体中的己糖激酶，因而通过糖酵解途径促进葡萄糖代谢。因此，可以推测，葡萄糖很可能是通过酵解产生丙酮酸，后者参与三羧酸循环提供卵母细胞成熟所需的能量。然而，有研究表明，葡萄糖诱导减数分裂的作用并不依赖糖酵解产生丙酮酸。例如，利用碘乙酸抑制葡萄糖酵解途径不影响黄体生成素(LH)诱导的减数分裂恢复。2-脱氧葡萄糖能够抑制FSH诱导的减数分裂恢复，但不抑制糖酵解途径。另外，向培养基中单独添加丙酮酸不提高卵母细胞中的ATP水平，丙酮酸或促性腺激素处理未增加COCs的耗氧量。由于发现嘌呤核苷酸生成途径参与促性腺激素诱导的减数分裂过程，葡萄糖的作用很可能通过磷酸戊糖途径来实现的，因为PPP途径能够提供5.磷酸核糖，用于嘌呤核苷酸生成通路的重要底物-磷酸核糖焦磷酸的合成。
　　 最近我们研究表明丙酮酸抑制小鼠卵母细胞老化，然而，卵丘细胞特别是丙酮酸调控卵母细胞的机理仍然不清楚。此外由于氧化应激能够引起细胞内氧化还原潜力失衡，导致早期胚胎凋亡并且排卵后卵母细胞老化，因此了解代谢如何调控卵母细胞氧化还原潜能具有非常重要的作用。此实验，我们用小鼠排卵后老化卵母细胞为模型，研究表明：
　　 1)卵母细胞本身能够利用丙酮酸或乳酸抑制老化，但只有存在卵丘细胞的情况下才能利用葡萄糖。卵丘细胞通过产生丙酮酸或乳酸抑制卵母细胞老化。
　　 2)新鲜COCs培养在含葡萄糖和不同浓度的DHEA(PPP抑制剂)和/或iodoacetate(糖酵解途径的抑制剂)CZB培养液中，结果表明随着药物浓度的增加，激活率增加，当抑制糖酵解时60％卵母细胞发生老化，当抑制PPP时，几乎所有的卵母细胞都老化。通过测细胞内总谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽/氧化型比值，表明PPP主要通过维持了谷胱甘肽的还原状态抑制卵母细胞老化。
　　 3)乳酸通过乳酸脱氢酶转变为丙酮酸抑制卵母细胞老化，丙酮酸不依赖与乳酸脱氢酶产生的乳酸；乳酸通过产生NADH而后进入呼吸链产生ATP抑制卵母细胞老化，而丙酮酸不完全依赖与呼吸链抑制卵母细胞老化。
　　 4)当用4-CIN抑制了单糖转运系统(能够将单糖转运入细胞或线粒体)，存在丙酮酸或乳酸，卵母细胞激活率都达到最高水平。表明丙酮酸或乳酸抑制卵母细胞老化涉及到了线粒体电子传递链并且在老化卵母细胞胞质或线粒体上MCT是有活性的。
　　 5)卵丘细胞中PPP或糖酵解通过产生丙酮酸抑制卵母细胞老化。丙酮酸通过其代谢进入线粒体抑制卵母细胞老化。
　　 6)缺乏能量供给，巯基物质的添加对卵母细胞老化和谷胱甘肽合成没有影响。存在能量物质时卵母细胞能合成谷胱甘肽，0.27mM丙酮酸通过调控细胞内的氧化还原状态和能量供给抑制卵母细胞老化，0.15mM丙酮酸时只能调控能量供给。
　　 第二部分：抑制卵母细胞老化对健康生殖和辅助生殖技术非常重要，低温降低细胞代谢并且降低ROS产生。研究表明低温抑制缺血后的凋亡，在大鼠中对弥散恼损伤后的细胞凋亡起抑制作用。有报道表明将牛卵巢保存于10,15或25℃对体外受精和体细胞核移植后的卵母细胞发育能力有保护作用，此外在体细胞中研究表明降低培养温度能够增加细胞活性，降低凋亡。我们研究表明丙酮酸通过维持能量供给和氧化还原潜力抑制小鼠卵母细胞体外老化，并且添加10mM丙酮酸，卵母细胞受精或孤雌激活后囊胚发育潜力维持6小时。我们假设通过降低培养温度并且给予充足的丙酮酸，卵母细胞老化可能会维持更长时间，研究结果表明：
　　 1)随着培养时间的延长，卵母细胞酒精激活率增加，增加丙酮酸浓度能够明显降低卵母细胞酒精激活率的增加；
　　 2)保存温度由37℃降到15℃，卵母细胞酒精激活率下降，但是在相同条件下5℃比15℃激活率要高；
　　 3)氯化锶处理后各保存组激活率没有差异，25℃保存24小时，15℃保存36小时和5℃保存24小时，卵母细胞囊胚发育率高达60％；
　　 4)除了5℃保持48小时受精率下降，其他处理组受精率没有差异。25℃保存24小时，15℃保存36小时和5℃保存24小时，卵母细胞受精后的囊胚率高达80％；
　　 5)将实验组15℃保存36小时卵母细胞受精后的二细胞或囊胚，和对照组新鲜卵受精后的二细胞或囊胚分别移植到受体小鼠输卵管伞和子宫内，妊娠率、产仔数、移植胚胎中发育到期的胚胎数和胎儿出生重实验组和对照组没有差异。
　　 6)卵母细胞在15℃中保存96小时和5℃中保存48小时发育能力受损，并且GSH含量、GSH/GSSG比例、BCL2浓度、含正常纺锤体和皮质颗粒的卵母细胞数都发生了不可逆的降低。
　　 总之，添加高浓度丙酮酸和适当低温相结合能够有效抑制小鼠卵母细胞老化，我们找到了保存成熟卵母细胞方法，即添加10.27mM丙酮酸，在15度中保存36小时。