禽波氏杆菌的定植规律、基因分型以及与REV共感染的协同致病作用研究

摘要

禽波氏杆菌(Bordetellaavium，B.avium)最早于1967年分离自火鸡，主要引起禽类的鼻炎、眼炎等呼吸道症状。近年来不断从出现孵化率降低和弱雏率增高的种鸡孵化场鸡胚中分离到该菌，为探明其致病性的变化，本研究对2001-2011年间出现疫情的规模化种鸡孵化场的致病病原进行了分析，然后对分离到的B.avium菌株进行了强毒株的筛选以及基因分型，对筛选到的强毒株进行了定植规律检测，并研究了其在免疫抑制状态下致病性的变化。
　　 本研究共分为五个部分：
　　 1.规模化种鸡孵化场胚胎性疫病病原分析
　　 本试验对2001～2011年间全国8省市共计72个种鸡孵化场送检或采集的将出壳死亡鸡胚或死亡的刚出壳雏鸡进行了病原的检测和分析。经多重PCR和RT-PCR扩增以及细菌、支原体的分离培养，在33个孵化场检测到了鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽网状内皮增殖症病毒(REV)和鸡白血病病毒(ALV)三种病毒的单纯感染和多重感染，占45.8％；有6个孵化场存在有支原体感染，占检测孵化场总数的8.33％；在52个孵化场检测到了细菌的单纯感染或多重感染，占到了72.2％。共分离到禽波氏杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和绿脓杆菌5种细菌，共计105株。在检测的47种药物中5类细菌耐受药物的数量在15-32种，耐药性总体呈上升趋势，其中以葡萄球菌的蜊药最为严重。孵化率下降、弱雏率增加等状况主要由细菌的多重感染(47.22％)和病毒与细菌的共感染(19.44％)引起，单纯的病毒、细菌和支原体的感染仅占了极少的比例，分别为6.94％、9.72％和4.71％。
　　 2.B.avium鸡胚分离株的生物学特性及致病性研究
　　 1991-2010年间分离到的22株B.avium菌株的培养特性及尘化特征基本一致，且均具有不同程度的耐药性。在所检测的47种药物中，不同分离株耐受药物数量为8-30种。对近年来的12株鸡胚分离株进行11日龄鸡胚ELD50和1日龄雏鸡LD50的测定，结果发现ELD50在6.75-27.95CFU之间，LD50在9.2×105-3.4×108CFU之间，从中筛选出3株毒力较强的菌株Ba15、Ba17和Ba21。3株B.avium经鼻腔感染1日龄雏鸡后发现Ba15对雏鸡的生长抑制和ND油苗免疫后的抗体水平增长的抑制作用最强，在肺脏和气管中的感染率为100％，在各内脏中引起感染的鸡只比例在30％～40％。对Ba15以不同方式感染雏鸡发现腹腔感染的危害最严重，生长抑制和免疫抑制作用最强，内脏的感染比例最高(100％)，比较接近胚胎期感染，经鼻腔和经眼两种方式感染的比较发现鼻腔感染的危害略强于经眼感染，B.avium入侵内脏的鸡只比例分别为30-40％和30％。
　　 3.禽波氏杆菌鼻腔攻毒雏鸡的定植规律研究
　　 用筛选到的强毒株Ba15经鼻腔感染1d雏鸡，采用组织匀浆涂布细菌计数法、接种环划线法、抹片染色法以及建立的细胞内抗原原位检测的间接免疫酶和间接免疫荧光组化法进行细菌感染后在组织中的实时和定位检测，在感染后1h即可在气管和肺脏中检测到少量的B.avium，攻毒后12h内肺脏中细菌的数量急剧上升，5d时入侵肝脏、心脏和脾脏，7d时发现其在肾脏的感染。内脏感染后的荷菌数量高峰期出现在14-28日龄，35日龄后在内脏中的感染比例逐渐下降，和B.avium感染后抗体水平的增长以及抗病能力的增强直接相关。经过间接免疫酶和间接免疫荧光组化检测B.avium感染后在组织细胞中的定植部位主要是位于胞浆和细胞间质中，且呈弥散性分布。
　　 4.禽波氏杆菌RAPD基因分型研究
　　 用细菌基因组抽提试剂盒对22株禽波氏杆菌的DNA进行提取，获得了高纯度和高浓度的细菌基因组DNA，并建立了稳定性和重复性好的RAPD扩增程序。经过对一系列随机引物的筛选，有6条引物能够产生清晰且多态性好的条带。运用筛选的6条随机引物对22株B.avium进行扩增，获得了RAPD指纹图谱。运用分析软件对指纹图谱进行统计分析，计算出各菌株间的遗传距离并进行聚类分析，绘制亲缘关系树状图，最终以遗传距离0.402为界将22株B.avium分成了3个聚类群，其中第一聚类群又可以分为3个亚群，第三聚类群可以分为两个亚群。其中第一聚类群包括了2000年之前的10个分离株(Ba1-Ba10)和2001年之后分离到的Ba12、Ba13、Ba14、Ba20,第二聚类群和第三聚类群中均为2001年之后的分离株，其中Ba15、Ba17、Ba18、Ba22属于第二聚类群，Ba11、Ba16、Ba19和Ba21属于第三聚类群。
　　 5.REV与禽波氏杆菌共感染的致病作用研究
　　 B.avium单纯感染鸡胚致病力较弱，鸡胚死亡时间较晚，主要危害是产生大量弱雏，且孵出的雏鸡长期带菌，生长缓慢，产蛋日龄延后。REV与B.avium共感染鸡胚比B。avium单纯感染时的鸡胚死亡时间提前，孵化率仅为30％，死胚率、弱雏率增高，且弱雏的最终成活率为0。B.avium单纯感染和与REV的共感染对不同日龄雏鸡的LD50的检测表明，雏鸡的感染日龄至关重要，不管是单纯感染组还是共感染组，高日龄的LD50值明显高于低日龄感染组。胚胎期及1日龄REV感染均显箸降低了B.avium对不同日龄雏鸡LD50,尤其是胚胎期REV后B.avium对1日龄雏鸡的LD50值最低。REV作为一种免疫抑制性病毒，感染越早对B.avium的LD50影响越大。
　　 B.avium单纯鼻腔感染对雏鸡的生长抑制和免疫抑制作用均较弱，但胚胎期REV感染的雏鸡再经鼻腔感染B.avium后，对生长抑制和免疫抑制均具有协同作用，尤其是免疫抑制方面，尽管是以REV引起为主，但与B.avium共感染后加快了免疫器官细胞的凋亡、坏死，并且使抗体水平的持续时间缩短。另外共感染还提高了鸡群中“僵鸡”的比例，使B.avium在内脏中的检出时间提前、感染比例增大，并且在内脏中的持续感染时间延长，同时还发现在共感染组中继发其他细菌感染的病例数增多。
　　 B.avium单纯于1、7、14、和21日龄经鼻腔感染雏鸡时发现，感染日龄至关重要，1日龄和7日龄的雏鸡比较敏感，21日龄感染组症状上仅表现为一过性感染。不同日龄感染组之间相比，感染日龄越低对雏鸡的生长抑制和免疫抑制越严重，B.avium入侵内脏的病例数也越多。1日龄雏鸡感染REV后再分别于1、7、14、和21日龄经鼻腔感染B.avium发现，在对雏鸡的生长抑制和免疫抑制上具有一定的协同作用，并且各日龄共感染组与单纯感染组相比内脏的感染比例均有不同程度的增加。在共感染组中低日龄时雏鸡对B.avium的易感性仍强于高日龄，但感染日龄之间的差异在显著缩小。
　　 总之，本研究结果表明我国种鸡孵化场的胚胎性疫病多病原共感染的现象非常普遍，用RAPD方法将十年来的B.avium流行株分成了三个聚类群，并从分离到的B.avium鸡胚分离株中筛选出一株强毒株，对其进行了定植规律和与REV共感染的致病研究，发现在免疫抑制状态下，B.avium入侵内脏的时间提前，感染比例增大，病理损伤更严重，且对生长抑制和免疫抑制具有明显的协同作用，继发细菌感染的病例增多，大大增加了B.avium在鸡群中的危害。