表达pri-mir-302/367基因的慢病毒颗粒的制备及其感染人脐血单个核细胞的实验究

摘要

目的:制备可诱导表达pri-mir-302/367基因的重组慢病毒颗粒，并在HeLa细胞中研究该基因对多能性基因的调控作用；通过病毒感染人脐血单个核细胞（human cord blood mononuclear cells，hCBMNC），旨在探究该基因对hCBMNC的重编程作用。
　　方法:（1）以正常人基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因，将目的基因连接入酶切线性化的pLV-TRE质粒，构建pLV-TRE-302慢病毒重组体，酶切及测序予以鉴定。（2）通过重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞对慢病毒进行包装及滴度测定；用病毒转染HeLa细胞，强力霉素（doxycline,DOX）诱导后，通过real time-PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因Oct4、Sox2和Nanog的表达情况。（3）用病毒感染hCBMNC，经DOX诱导后，在胚胎干细胞培养基培养条件下观察其形态学变化，并用real time-PCR分别检测多能性基因Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和c-Myc的表达情况。
　　结果:（1）成功制备pri-mir-302/367重组慢病毒颗粒，基因测序结果与目标序列完全一致，病毒滴度为5×106TU/mL。（2）DOX诱导72 h后，real time-PCR结果显示HeLa细胞中miR-302/367家族基因及受其调节的多能性基因均得到不同程度的上调。（3）经重组慢病毒感染的hCBMNC未见克隆形成，但real time-PCR结果显示其多能性基因Oct4、Sox2和Nanog均得到上调。
　　结论:本研究成功制备表达pri-mir-302/367的重组慢病毒颗粒，并在He La细胞中初步验证该基因对多能性基因的调控作用；通过观察和检测受病毒感染的hCBMNC形态学及相关基因的变化，初步探讨了诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）研究的关键技术，为后续的重编程研究奠定了实验基础。

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前言

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

1.重组慢病毒载体的构建

2.转染效率的检测及慢病毒滴度测定

3.real time-PCR检测miR-302/367家族基因在HeLa细胞中的表达

4.real time-PCR检测多能性基因在HeLa细胞中的表达情况

5.p L V-TRE-302重组慢病毒载体感染hC BMNC后形态学变化

6.在h C BMNC中检测多能性基因ONSKC的表达水平

讨论

结论

参考文献

综述

综述参考文献

致谢

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