小麦脱镁吐绿酸α加氧酶基因(TaPaO)的克隆及表达分析

摘要

在高等植物中，健康生长的叶片对光合作用来说是至关重要的。然而，叶片的衰老将会导致光合作用能力的下降。叶片衰老是植物叶片发育的最后阶段，最终导致整个叶片的死亡。叶片衰老被认为是一种具有高度组织性的由基因控制的程序化死亡过程。在细胞水平上表现为叶绿素的降解、蛋白质和核酸的水解、游离氨基酸积累以及多种蛋白酶和生长抑制因子活性上调等。其中，叶绿素降解是叶片衰老过程中最明显的现象。在叶绿素的降解中，脱镁叶绿酸α加氧酶(pheophorbideαoxygenase，PaO)被认为是最重要的酶。PaO通过催化氧原子的加入，使脱镁叶绿酸α的卟啉环开环，形成红色叶绿素降解物(red chlorophyll catabolite，RCC)。PaO基因最早在玉米中被发现，后从多种植物中被分离出来。本研究以重要的粮食作物小麦(Triticum aestivum)为实验材料，首次从小麦中克隆得到PαO基因，并对其进行了序列分析和表达特异性分析，为进一步明确PaO的功能及作用机理奠定了基础。主要研究结果如下：
　　 (1)利用生物信息学分析方法和RACE技术，从小麦中克隆得到了一个PαO基因，并命名为TαPαO(GenBank注册号：JN689384)。该基因cDNA全长1841bp，包括1572bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)，48bp的5’非编码区(untranslated region，UTR)和221bp的3’UTR。该基因编码由523个氨基酸组成的蛋白TaPaO，预测其分子量大约为58.3kDa，等电点(isoelectricpoint，pI)值为7.17。进一步的分析预测显示，TaPaO蛋白定位在叶绿体，其N端具有由38个氨基酸组成的叶绿体转运肽，剪切位点位于R38和V39之间。TaPaO具有PaO蛋白特有的保守结构域，包括Rieske型(2Fe-2S)结构域、单核铁结合结构域和C末端CxxC基序。蛋白质序列同源比较表明，TaPaO与其它植物的PaO蛋白具有很高的同源性。TaPaO与HvPaO、SbPaO、ZmPaO、AtPaO、GmPaO的同源性分别达到了93％，83％，79％，69％和65％。聚类分析表明，TaPaO与大麦HvPaO的亲缘关系最近。
　　 (2)利用实时荧光定量PCR的方法，研究了TaPaO在小麦幼苗不同组织中的表达特性。结果表明，TaPaO在根茎叶中均能表达，TaPaO在叶片中的表达量明显高于其在茎和根中的表达量。
　　 (3)利用实时荧光定量PCR的方法，对外源施加植物激素的小麦植株中TaPaO的表达进行了分析。结果发现，在脱落酸(abscisic acid，ABA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)的诱导下，TaPaO基因的表达都有不同程度的增加，然而赤霉素(gibberellin，GA)和水杨酸(salicylic acid，SA)对TaPaO基因的表达并没有显著的影响。这表明TaPaO的表达可能受ABA和MeJA依赖的防御信号途径的调控。
　　 (4)利用实时荧光定量PCR的方法，对各种非生物和生物胁迫的诱导下TaPaO的表达进行了分析。结果发现，在高盐(200mMNaCl)、低温(4℃)以及伤胁迫等非生物胁迫的诱导下，TaPaO基因的表达都是上调的。在叶锈菌侵染的小麦植株中，TaPaO基因的表达也是上调的。然而，条锈菌的侵染对TaPaO基因表达的影响并不明显。总之，以上研究结果表明TaPaO可能参与到小麦植株对各种非生物和生物胁迫条件的防御反应。