南蛇藤生物活性成分分析及其抗动脉粥样硬化药效评价

摘要

1.毛细管电泳法分析南蛇藤中黄酮类物质成分及其含量分布
　　 建立同时测定南蛇藤中芦丁、山奈酚及槲皮素含量的毛细管电泳法，分析结果差异，探讨南蛇藤的药用质量控制方法:采用30 mmol·L-1硼酸钠缓冲液(PH=9.0)，20kV分离电压条件下，254nm波长下毛细管电泳法测定芦丁、山萘酚、槲皮素含量。结果黄酮类物质芦丁、山萘酚和槲皮素的对照品在12 min内实现完全分离，在2.5-500μg·mL-1范围内呈良好的线性关系: YRT=841.7C+4919.3(r=0.998)；YKF=2599.1C+12999(r=0.999)；YQC=5111.8C+13570(r=0.999)。芦丁在皮、叶中含量高达1.41、1.37mg·g-1；山奈酚在皮中含量高达2.16 mg·g-1；槲皮素在根中含量可达0.016mg·g-1。研究表明南蛇藤中黄酮类物质含量丰富，不同部位中各黄酮含量有明显差异。毛细管电泳技术同时测定南蛇藤中芦丁、山奈酚与槲皮素具有较好的准确度和精密性，为临床和科研提供了一种简单快速的检测方法，同时为南蛇藤的药用质量控制提供了技术方法和坚实的理论数据。
　　 2.超声波提取-毛细管电泳技术联用优化南蛇藤中熊果酸与齐墩果酸提取工艺及其含量测定
　　 超声波技术-响应曲面法优化南蛇藤中熊果酸与齐墩果酸的提取工艺，建立一种毛细管电泳法同时测定南蛇藤中熊果酸和齐墩果酸含量的方法，并检测熊果酸与齐墩果酸在南蛇藤不同部位中的含量分布:分别以提取溶剂浓度、料液比、超声时间为考察因素，采用三因素三水平设计中心组合实验，优化熊果酸与齐墩果酸的提取工艺。以硼酸盐缓冲液浓度、pH值、分离电压为考察因素，筛选熊果酸与齐墩果酸的最佳分离条件。结果熊果酸和齐墩果酸的最佳提取条件为:以80％甲醇为提取溶剂，料液比(m/v)为1∶20，超声时间50min。以80mmol· L-1的硼酸盐缓冲液(pH=9.80)作为电离介质，20 kV分离电压，210 nm波长下，22 min内熊果酸和齐墩果酸得到很好的分离。二者线性方程分别为:YUA=300801x+1210.5(r=0.9992)和YOA=349265x+4118.3(r=0.9992)，检测范围分别为0.0624-0.187μg·μL-1，0.0348-0.1043μg·μL-1，回收率分别为97.23％、96.45％，变异系数(RSD)＜5.00％(n=6)。熊果酸在根中含量为0.37 mg·g-1，约为叶中的5.5倍。齐墩果酸在茎、皮中的含量为0.67、0.52 mg·g-1，约为叶中的3.7倍和2.8倍。超声技术-响应曲面优化熊果酸与齐墩果酸的提取工艺，毛细管电泳同时检测熊果酸与齐墩果酸含量，具有较好的准确度和精密性，为临床和科研提供了一种简单、快速、准确的检测方法。熊果酸与齐墩果酸在南蛇藤根、茎、叶、皮中均有分布，且不同部位中含量存在明显差异。
　　 3.超声波提取-毛细管电泳技术联用优化南蛇藤中南蛇藤素的提取工艺及其含量测定
　　 超声波提取-响应曲面法优化南蛇藤中南蛇藤素的提取工艺，建立毛细管电泳法测定南蛇藤素含量的方法并检测其在南蛇藤不同部位中的分布:分别以提取溶剂浓度、料液比、超声时间为考察因素，采用三因素三水平设计中心组合实验，优化南蛇藤素的提取工艺。以硼酸盐缓冲液浓度、pH值、分离电压为考察因素，筛选南蛇藤素的最佳电泳分离条件。结果南蛇藤素的最佳提取条件为:80％甲醇为提取溶剂，料液比（m/v）为1∶20，超声时间50min。以10％甲醇和70 mmol· L-1硼酸盐缓冲液(pH=9.00)作为电解液，分离电压22 kV，检测波长210 nm作为检测条件。南蛇藤素在15min内得到分离，YCL=543282x+1967.2(r=0.9920)，线性检测范围为0.039-0.117μg·μL-1。回收率为101.13％，变异系数(RSD)＜4.00％(n=6)。南蛇藤素在根、茎、皮、叶中的含量分别为5.13、1.51、0.32、0.34 mg·g-1。南蛇藤素主要存在于根中，约为茎中的3.4倍，皮和叶的15倍。南蛇藤素在南蛇藤根、茎、叶、皮中均有分布，且不同部位中含量存在明显差异。超声波提取-响应曲面法优化南蛇藤素的提取工艺，同时毛细管电泳检测其含量，具有较好的准确度和精密性，为临床和科研提供了一种简单、快速、准确的检测方法，同时为临床用药提供了参考数据。
　　 4.南蛇藤醇提物毒性和安全性实验研究
　　 研究中药南蛇藤醇提物的药物毒性和安全性:采用Kaerben法设计实验方案，寻找小鼠灌胃给予南蛇藤醇提物的最大耐受量(MTD)和半数致死量(LD50);在MTD范围内，灌胃给予小鼠0.0、2.5、5.0、10.0 g·kg-1南蛇藤醇提物21d，记录药物对小鼠毒副作用情况，分析肝脏形态及肝脏指数变化，酶法检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平。结果表明南蛇藤醇提物的MTD为10.0 g·kg-1，LD50为38.17 g·kg-1，95％可信限为38.14-38.19 g·kg-1。在MTD范围内灌胃给药，与对照组相比，肝脏形态学和肝脏指数无明显变化;5.0、10.0 g·kg-1组ALT升高显著(P＜0.01，P＜0.001)，10 g·kg-1组AST明显升高(P＜0.01）。因此确定南蛇藤醇提物最大耐受量为10.0 g·kg-1，在此范围内用药对机体毒性较小，能保证用药安全。
　　 5.南蛇藤改善高脂血症豚鼠血脂表型和减轻主动脉壁脂质沉积
　　 探讨南蛇藤对高脂血症豚鼠脂质代谢、动脉壁脂质沉积的作用及机制:48只英格兰雄性短毛豚鼠(260-310 g，5月龄)随机分为普通饮食对照组(CD)，高脂饮食模型组(HFD)，南蛇藤3个浓度处理组，即低剂量组(HFD-L，2.5 g·kg-1·d-1)、中剂量组(HFD-M，5.0 g·kg-1·d-1)和高剂量组(HFD-H，10.0 g·kg-1·d-1)，以及辛伐他汀组(HFD-S，20m g·kg-1·d-1)。连续药物干预8周后，测定血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)含量。快速蛋白分析(FPLC)技术分离血浆组分，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)分析极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和HDL-C的蛋白组分。采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)分析肝脏胆固醇逆向转运相关基因清道夫受体-BI(SR-BI)、低密度脂蛋白受体(LDL-R)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)和胆固醇7α-羟化酶1(CYP7α-1)表达。分别采用油红O染色和HE染色分析主动脉壁脂质沉积与肝脏脂肪性病变。采用Applygen试剂盒测定肝脏中TC、TG、游离胆固醇(FC)、胆固醇酯(CE)。结果显示，与高脂模型组比较，南蛇藤高剂量组TC、TG和Non-HDL-C分别下降45％，21％和49％，南蛇藤中、高剂量组分别升高HDL-C16％和20％。LDL和VLDL中apoB和apoE表达显著降低，而HDL中apoAⅠ表达明显增加;南蛇藤可显著上调SR-BI、LDL-R、CYP7α1和HMG-CoA mRNA水平。南蛇藤显著减少动脉壁中脂质沉积与肝脏脂肪病变，明显降低肝脏中TC、TG、FC和CE水平。
　　 研究证明南蛇藤可抑制高脂血症豚鼠主动脉壁脂质沉积，其机制与改善高脂血症豚鼠血脂表型、减轻脂质氧化、增强促胆固醇逆向转运相关基因表达有关。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 研究意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 南蛇藤属植物药效成分研究现状

1．2．2 南蛇藤属植物抗动脉粥样硬化作用研究现状

1．2．3 动脉粥样硬化疾病研究现状

2 材料与方法

2．1 实验仪器

2．2 主要材料与试剂

2．3 毛细管电泳法分析南蛇藤中黄酮类物质成分及其含量分布

2．4 超声波提取-毛细管电泳技术联用优化南蛇藤中熊果酸与齐墩果酸提取工艺及其含量测定

2．5 超声波提取-毛细管电泳技术联用优化南蛇藤中南蛇藤素的提取工艺及其含量测定

2．6 南蛇藤醇提物毒性和安全性实验研究

2．7 南蛇藤对高脂血症豚鼠血脂表型和主动脉壁脂质沉积的影响

3 结果与分析

3．1 南蛇藤不同部位中黄酮类物质的含量分布

3．2 齐墩果酸与熊果酸提取工艺条件优化及在南蛇藤不同部位中的含量分布

3．3 南蛇藤素提取工艺条件的优化及在南蛇藤不同部位中的含量分布

3．4 南蛇藤醇提物安全性检测结果

3．5 南蛇藤改善了高脂血症豚鼠血脂表型 减轻了主动脉壁脂质沉积

3．6 南蛇藤抑制了致动脉粥样硬化炎症因子的表达

4 讨论

5 结论

六 展望

参考文献

致谢

8 博士期间发表论文和主持课题