拮抗链霉菌S24抗菌物质的分离纯化与结构初步解析

摘要

黄曲霉毒素(Aflatoxins AFT)是黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒代谢产物,具有极强的致癌、致畸和致突变作用,已被国际癌症研究组织(IARC)确定为1类致癌物。在我国的华中、华南和华北,黄曲霉毒素产毒株较多。人类食用被黄曲霉毒素污染的食品可引起中毒,急性中毒可引起肝脏坏死出血,而慢性中毒则会引起肝癌。用被黄曲霉毒素污染的饲料饲养畜禽能使畜禽生产率降低、增重减缓,严重危害动物的健康。
　　近几年来,研究者们一直在寻找对黄曲霉毒素进行有效防治的技术和策略,很多研究都集中在毒素脱毒技术的改进及检测方法的优化等方面,已有部分研究着开始利用植物源与微生物源活性物质来防治黄曲霉毒素。
　　拮抗链霉菌S24是本实验室从泰山林地土壤中分离并鉴定的一株白网链霉菌Streptomyces albireticuli近似种(Genbank注册号为FJ596182,菌株专利保藏编号为CGMCC3503)。该菌株及其产生的抗菌物质抗菌谱广、发酵性状优异,显示了诱人的开发前景。本研究对该菌株产生的抗菌物质进行分离纯化和结构鉴别。主要内容如下:
　　1、S24菌株产生的抗菌物质的分离纯化
　　将S24菌株进行发酵,发酵液经大孔吸附树脂X-5吸附解吸,得到抗菌物质的粗物,用甲醇对抗菌物质粗物进行抽提,得到抗菌物质的甲醇抽提物。用N,N-二甲基甲酰胺溶解抗菌物质的甲醇抽提物,逐渐加水,析出抗菌活性组分,将该活性组分再次溶于N,N-二甲基甲酰胺,逐渐加水,析出抗菌物质活性组分,将该活性组分旋转蒸发、冷冻干燥后,得到S24抗菌物质活性组分的中间纯化物。
　　通过HPLC对抗菌物质进行制备,抗菌物质的最佳制备色谱条件为:乙腈:水=32:68(v/v);色谱柱Welch Ultimate LP-C18柱(4.6mm×250mm,5μm),流速5.0mL/min,柱温30℃,进样量5mL,检测波长333nm。共获得A、B、C、D、E5个活性组分,分别收集各个活性组分进行二次制备并进行纯度检测,旋转蒸发、冷冻干燥,得到各个活性组分的纯品。
　　2、S24产生的抗菌物质的结构初步解析
　　采用FTICR-MS对A、B、C、D、E5个活性组分进行质谱分析,得到了5个活性组分的分子量以及可能的分子式,活性组分A:分子量为783.41001,可能的分子式为C39H61NO15;活性组分B:分子量为781.39434,可能的分子式为C40H63NO14,C36H63NO17和C32H63NO20;活性组分C:分子量为797.42499,可能的分子式为C40H63NO15;活性组分D:分子量为795.41539,可能的分子式为C37H65NO17,C33H65NO20和C41H65NO14;活性组分E:分子量为765.40281,可能的分子式为C40H63NO13和C36H63NO16。
　　3、抗菌物质活性组分B对黄曲霉的MIC和对黄曲霉细胞膜通透性的影响
　　抗菌物质活性组分B在较低的浓度下就能够抑制和杀死供试病原菌,对黄曲霉的MIC为3.125μg/mL。抗菌物质活性组分B能够改变黄曲霉菌体的细胞膜通透性,使核酸染料Sytox Green进入细胞内并与核酸结合,发出荧光。抗菌物质活性组分B的浓度越高,对黄曲霉菌体细胞膜通透性的影响越大,进入细胞内的核酸染料Sytox Green越多,荧光越强。

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1 前言

1.1 黄曲霉及其产生的毒素

1.2 多烯大环内酯类抗生素

1.3 傅立叶变换离子回旋共振质谱在天然产物分析方面的应用

1.4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 S24菌株产生的抗菌物质的中间纯化结果

3.2 S24菌株产生的抗菌物质的精制结果

3.3 S24菌株产生的抗菌物质的结构初步解析

4 讨论

4.1 S24菌株产生的抗菌物质的分离纯化

4.2 S24菌株产生的抗菌物质的结构初步解析

4.3 活性组分B对黄曲霉的MIC和对黄曲霉细胞膜通透性的影响

5 结论

5.1 S24菌株产生的抗菌物质的分离纯化

5.2 S24菌株产生的抗菌物质的结构初步解析

5.3活性组分B对黄曲霉的MIC和对黄曲霉细胞膜通透性的影响

5.4 关于试验中存在的问题和进一步研究的设想

参考文献

致谢