花生油脂合成关键酶基因GPAT9和LPAAT的分子特征及在籽仁中的表达分析

摘要

花生是我国重要的油料作物和经济作物，培育高油品种是花生育种的重要目标之一。种子油脂的主要成分三酰甘油TAG，是由一分子甘油与三分子脂肪酸经三次酯化反应合成，三次酯化反应依次由GPAT、LPAAT和DGAT催化完成。本研究利用同源克隆技术，从10个花生栽培品种中分离得到AhGPAT9序列，分析了其核苷酸序列多态性、籽仁中转录水平基因表达量与含油量之间的关系，构建了该基因的植物表达载体;并且从8个栽培品种和4个二倍体野生种材料中克隆到了LPAAT基因序列，分析了其序列特征。
　　 主要研究结果如下:
　　 (1)花生AhGPAT9的序列分析
　　 从栽培品种兰娜1号中克隆得到AhGPAT9的2条cDNA序列和2条DNA序列，AhGPAT9无内含子，将基因的2条DNA序列分别命名为Ahgpat9-1和Ahgpat9-2，二者开放阅读框均为1131 bp，编码376个氨基酸。生物信息学分析表明，AhGPAT9蛋白具有典型的酰基转移酶保守结构域和在所有酰基转移酶家族中高度保守的4个基序，含3个跨膜区域，与拟南芥、油桐和水稻等的GPAT9氨基酸序列一致性为73.67％-83.78％。
　　 10个品种间Ahgpat9-2核苷酸序列相同，Ahgpat9-1序列存在等位变异。根据Ahgpat9-1的变异位点将10个品种分为2组，其中兰娜1号、Krapt.st.16、花育32号和如皋西洋生为第一组，其余6个品种为第二组。每组内各品种的Ahgpat9-1序列无碱基差异;两组间Ahgpat9-1序列在第458 bp和第594bp处存在2个单核苷酸差异，导致所编码的氨基酸序列1个氨基酸残基的差异。第一组品种Ahgpat9-1和Ahgpat9-2序列间存在7个SNP位点，同源性为99.38％，推导的氨基酸序列存在1个氨基酸残基的差异;第二组品种的两序列间存在9个SNP变异位点，同源性为99.20％、所编码的氨基酸序列有2个氨基酸残基的差异。
　　 (2)花生籽仁中AhGPAT9的表达分析
　　 同一品种种子发育不同时期，AhGPAT9的表达量差异极显著;不同含油量品种AhGPAT9的表达趋势存在差异，表达趋势相同的品种间种子含油量与AhGPAT9表达量呈正相关，果针入土50d前基因表达量峰值较高或峰值持续时间较长均有利于油脂积累。
　　 (3)花生GPAT9植物表达载体的构建
　　 用限制性内切酶BamHI和ⅣotI对携带AhGPAT9基因序列的重组质粒pEASY-T1和表达载体pGBVE同时进行双酶切，回收目的DNA和载体大片段DNA，用T4 DNA连接酶连接，之后转入大肠杆菌感受态细胞Trans-T1，检测结果表明携带AhGPAT9的超表达载体pGBGP构建成功，并将pGBGP重组质粒转入农杆菌感受态细胞LBA4404。
　　 (4)花生PAAT的序列分析
　　 从8个花生栽培品种中分别获得2条cDNA序列（命名为rlpaat-1和rlpaat-2），品种间相对应序列无碱基差异。rlpaat-1和rlpaat-2之间存在11个SNP位点，开放阅读框均为1131 bp，编码376个氨基酸，对应的氨基酸序列LPAAT-1和LPAAT-2有1个氨基酸残基的差异。LPAAT蛋白具有典型的酰基转移酶功能结构域以及4个保守基序。从栽培品种花育32号克隆得到LPAAT的两条DNA序列（命名为glpaat-1和glpaat-2），长度分别为3729 bp和3736 bp，均包含12个外显子和11个内含子，二者存在37处碱基差异，其中34处为SNP位点。4个花生区组二倍体野生种A.correntina，A.duranensis，A.batizocoi和A.ipaensis中各获得1条LPAAT序列，长度分别为3757 bp，3757 bp，3742 bp和3756 bp。核苷酸序列多态性和系统进化树分析表明，栽培品种LPAAT的两条序列glpaat-2与glpaat-1分别来自A、B染色体组。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 植物油脂的合成途径

1．2 甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)的研究进展

1．3 溶血磷脂酸酰基转移酶基因(LPAAT)的研究进展

1．4 二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)的研究进展

1．5 花生栽培种的起源研究

1．5．1 花生区组的来源和染色体特点

1．5．2 花生栽培种与二倍体野生种间亲缘关系的研究进展

1．6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 花生GPAT9和LPAAT的克隆试验

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 试验方法

2．2 花生种子AhGPAT9的表达差异检测

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验方法

2．3 GPAT9表达载体的构建

2．3．1 菌种和质粒

2．3．2 酶和试剂

2．3．3 试验方法

3 结果与分析

3．1 花生种子含油量分析

3．2 花生GPAT9的克隆及分析

3．2．1 籽仁总RNA及cDNA的电泳检测

3．2．2 AhGPAT9的核苷酸序列分析

3．2．3 AhGPAT9推导的氨基酸序列分析

3．2．4 不同花生品种籽仁AhGPAT9的表达差异分析

3．2．5 AhGPAT9植物超表达载体构建

3．3 花生LPAAT的克隆及分析

3．3．1 LPAAT的核苷酸序列分析

3．3．2 LPAAT蛋白的生物信息学分析

3．3．3 栽培种与野生种LPAAT核苷酸序列的系统进化分析

4 讨论

4．1 不同栽培品种AhGPAT9的等位变异分析

4．2 花生种子发育过程中AhGPAT9的相对表达量与品种含油量的相关性分析

4．3 花生LPAAT的序列分析

4．4 花生GPAT蛋白的跨膜结构

4．5 关于本试验取样时期设计的问题

4．6 植物表达载体的构建意义及注意事项

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况