下丘脑AMPK及mTOR通路在LPS诱导厌食中的作用

摘要

本课题22研究了腹腔注射菌体脂多糖(LPS)，激活核因子(NF-κB)信号通路对食欲调节机制的影响。通过对LPS诱导厌食机制的研究，筛选出调节采食的关键基因及蛋白，从而确定了采用中枢灌注药物的方法，干预LPS诱导的动物厌食，为改善LPS诱导的动物厌食提供理论依据。
　　 试验一:体重相近的8周龄健康小鼠24只，随机均分成4组，饲养在环境控制的鼠房内，室内温度控制在23±0.1自由采食和饮水。试验期，小鼠禁食24小时后，分别按照0，10，100，1000μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS。分别记录注射后1、2、4、6、12、24小时的采食量及体重。结果发现:与对照组相比，LPS处理的所有时间点的采食量均显著降低(p＜0.01)，处理组内小鼠24h的体重也显著降低，但24小时以后，10μg及100μg处理组的小鼠的体重均出现了恢复;在LPS处理组中，随着LPS浓度的增加，动物的采食量和体重显著降低。以上结果表明:LPS能够降低动物的采食和体重，并且呈现剂量依赖性。
　　 试验二:8周龄体重相近的健康小鼠36只，随机均分成4组，饲养在环境控制的鼠房内，温度控制在23±0.1由采食和饮水。试验前，所有小鼠禁食24h后，于18:00点分别按照0，100，500μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS。注射LPS2小时后，将小鼠颈部移位处死，并迅速剥离下丘脑，进行样品分析。试验结果表明:LPS处理显著的提高了下丘脑内抑制食欲的基因POMC的mRNA水平(p＜0.05)。利用Western Bloting技术测定下丘脑内FoxO1的磷酸化水平，发现FoxO1在Ser256和Thr24/FoxO3a(Thr32)位点的磷酸化水平显著上调(p＜0.05)，并且显著增强了细胞浆内FoxO1的水平(p＜0.05);在测定细胞因子的基因表达量时，发现LPS处理显著提高了IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平(p＜0.05);NF-κB蛋白磷酸化测定过程中，发现LPS处理显著地提高了NF-κB在Ser536位点的磷酸化水平(p＜0.05)，同时细胞核内NF-κB在该位点的磷酸化水平也显著提高;除此之外，AMPK在Thr172位点的磷酸化水平显著下调，而mTOR在Ser2448位点及P70S6K在Thr389位点的磷酸化水平均显著上调。上述结果提示:LPS处理可能是通过增加细胞因子的释放，从而激活NF-κB信号通路，引起食欲基因的变化，而影响动物的采食量;另外，AMPK以及mTOR信号可能也参与了LPS引起的动物厌食。
　　 试验三:试验选用体重相近的8周龄雄性昆明小鼠24只，随机均分为A、B、C、D4个组。禁食24小时后，于18:00点A、C组小鼠脑室注射人工脑脊液(artificialcerebrospinal fluid，ACSF)，B、D组小鼠脑室注射AICAR。脑室注射1小时后，A、B组小鼠再腹腔注射LPS(500μg/kg BW)，C、D两组注射生理盐水，记录采食量。样品采集:在小鼠腹腔注射2h后，将小鼠颈部移位处死，随后迅速剥离下丘脑，进行样品分析。结果显示:脑室注射AICAR没有影响LPS组小鼠的采食量(p＞0.05)，提示AMPK信号通路可能不是LPS诱导动物厌食中的关键通路。
　　 试验四:体重相近的8周龄雄性昆明小鼠24只，单笼饲养，饲喂基础日粮，自由饮水。试验期将小鼠随机平均分成A、B、C、D四个组。所有小鼠提前禁食24h后，于18:00点，A、C组脑室注射人工脑脊液1μl，C、D组按照20μg/μl的剂量脑室注射mTOR阻断剂Rapamycin1μl。脑室注射1小时后，B、D组按照500μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS，另外两组注射同剂量的生理盐水。记录1，2，4，6，12，24小时的采食量。样品采集:在小鼠腹腔注射2h后，将小鼠颈部移位处死，随后迅速剥离下丘脑，进行样品分析。由结果可知:脑室注射Rapamycin显著提高了LPS诱导的厌食小鼠的采食量(p＜0.05)，显著的下调了抑食基因POMC的mRNA水平(p＜0.05)，显著的提高了NPY/AgRP的mRNA水平(p＜0.05);测定细胞因子的mRNA水平发现，脑室注射Rapamycin，显著降低了细胞因子IL-1α、TNF-α的mRNA水平(p＜0.05)，IL-1β的mRNA水平呈现下调的趋势，而IL-6的mRNA水平没有显著的变化;另外，Rapamycin处理显著降低了LPS诱导的FoxO1、NF-κB、mTOR、P70S6K的高磷酸化水平(p＜0.05)。以上所述结果提示:Rapamycin可能是通过降低细胞因子的释放水平，使得调节食欲基因表达的蛋白的功能的恢复，从而食欲基因的表达得到改善，继而使LPS诱导的小鼠的采食量增加。

目录

声明

缩略词(Abbreviations)

摘要

1 前言

1．1 厌食的定义及其影响

1．2 诱导厌食的因素

1．2．1 常见的细菌性感染致病原-LPS

1．2．2 炎症细胞因子的种类及作用

1．3 NF-κB信号通路

1．3．1 NF-κB家族

1．3．2 NF-κB信号通路的功能

1．4 中枢神经系统的采食调控

1．4．1 下丘脑的采食调控

1．4．2 FoxO蛋白家族在采食调控中的作用

1．5 细胞因子对采食中枢的调控作用

1．6 AMPK信号通路在采食调控中的作用

1．7 mTOR信号通路在采食调控中的作用

1．8 本课题的研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物与日粮

2．1．2 试验试剂与仪器

2．2 试验方法

2．2．1 构建LPS刺激导致的动物厌食模型(试验一)

2．2．2 研究LPS构建的动物模型中，激活NF-κB信号通路对食欲调节机制的影响(试验二)

2．2．3 研究通过中枢注射5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside(AICAR)激活下丘脑AMPK信号通路对LPS导致的厌食的调节(试验三)

2．2．4 研究通过中枢注射Rapamycin阻断下丘脑mTOR信号通路对LPS导致的厌食的调节(试验四)

2．3 数据分析

3 结果分析

3．1 腹腔注射LPS对动物的采食量、体重的影响

3．1．1 腹腔注射LPS对采食量的影响

3．1．2 腹腔注射LPS对体重的影响

3．2 LPS厌食模型中，激活NF-κB信号通路对食欲调节机制的影响

3．2．1 LPS刺激对炎症因子及NF-κB信号通路的影响

3．2．2 LPS刺激对食欲基因及FoxO1的影响

3．3 AMPK信号通路在LPS诱导厌食中的作用

3．3．1 LPS处理抑制AMPK的蛋白表达

3．3．2 中枢注射AMPK激活剂5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside(AICAR)对LPS诱导厌食的影响

3．4 mTOR通路在LPS诱导厌食中的作用

3．4．1 LPS处理促进mTOR通路的激活

3．4．2 中枢注射mTOR抑制剂Rapamycin，对LPS诱导厌食的作用

4 讨论

4．1 腹腔注射LPS降低小鼠采食量并上调炎症细胞因子mRNA表达及NF-κB蛋白的磷酸化水平

4．2 腹腔注射LPS改变食欲调控基因的mRNA表达水平且上调FoxO1蛋白的磷酸化水平

4．3 AMPK信号通路在LPS诱导小鼠厌食中的作用

4．3．1 腹腔注射LPS对小鼠下丘脑AMPK的影响

4．3．2 中枢注射AICAR对LPS导致的厌食小鼠的采食量的影响

4．4 下丘脑mTOR信号通路在LPS导致的动物厌食中的作用

4．4．1 腹腔注射LPS对小鼠下丘脑mTOR的影响

4．4．2 中枢注射Rapamycin对LPS导致的厌食小鼠的采食量及食欲调节基因的表达量的影响

4．4．3 中枢注射Rapamycin对FoxO1磷酸化水平的影响

4．4．4 中枢注射Rapamycin对细胞因子基因表达量的影响

4．4．5 中枢注射Rapamycin对NF-κB磷酸化水平的影响

5 总体结论与研究进展

5．1 结论

5．2 课题创新与研究展望

5．2．1 课题创新

5．2．2 研究展望

参考文献

致谢