球等鞭金藻中烯酰-ACP还原酶基因的克隆、转录分析以及环境胁迫下脂肪酸分析

摘要

烯酰-ACP还原酶在脂肪酸合成代谢中起到至关重要的作用，它使底物烯酰-ACP还原成酰基-ACP，催化不饱和C=C键还原成饱和的C-C键，是脂肪酸从头合成的最后一步，是催化烯酰-ACP还原成酰基-ACP必须的酶;而且能够调节饱和和不饱和脂肪酸的含量，参与催化合成超长链的脂肪酸。
　　 本研究根据球等鞭金藻Isochrysis galbana CCMM5001构建的cDNA文库中部分IgENR序列设计引物，应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆cDNA全长序列，进一步获得DNA序列，并提交到GenBank（GenBank接收号:JQ309976和JQ903585），并对其进行了全面的生物信息学分析。分析结果可知:IgENR序列全长1053bp，包含了14bp的5'UTR和445bp3'UTR，ORF长1044bp，编码347个氨基酸，终止密码子为TGA，分子量计算值(MW)为36.3kDa，理论等电点(PI)为5.24。获得的IgENR DNA序列共2253bp包含4个内含子，四个内含子都含有典型的GT/AG剪切信号。IgENR的氨基酸序列与海链藻（Thalassiosira pseudonana，EED93672）、三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum，EEC50745）、烟草(Nicotiana tabacum，CAA74176)和拟南芥(Arabidopsisthaliana，AAF37208)的ENR氨基酸序列同源性较高。
　　 应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术，以β-actin基因为内参基因，研究了球等鞭金藻在低温、适温、高温和不同氮元素浓度(0mg/L、75 mg/L、150 mg/L)培养下IgENR基因的表达变化。温度胁迫下，随温度的升高IgENR的表达水平升高，在温度为35℃时，IgENR基因的转录水平比15℃和25℃高，最高值为对照组的66.6倍远高于15℃和25℃下IgENR基因的转录水平;不同氮浓度胁迫下，随培养基中氮浓度的升高IgENR的表达水平升高，氮浓度过量(150mg/L)时，IgENR基因在48h表达水平达到最大，之后表达量逐渐下降。由此可见，升高温度或者提高氮浓度能上调IgENR基因的表达。
　　 本次试验研究了不同培养条件对其生长和总脂积累的影响。结果表明，低氮和常温利于油脂的积累，过低和过高温度和过高的氮浓度则不利于油脂的积累。此外，从微藻脂肪酸组成来看，在低温15℃条件下，有利于积累不饱和脂肪酸PUFAs，达到相对含量的57.56％。该藻最适生长的温度以及氮浓度分别为:25℃和氮浓度75mg/L;最适宜总脂积累的条件:氮浓度0mg/L。
　　 本论文的研究结果为进一步研究球等鞭金藻不同培养条件下IgENR基因相对表达以及脂肪酸积累状况提供有价值的理论依据。这不仅对于藻类在生理和生态学适应环境方面具有重要作用，而且对全面了解和认识酰基-ACP还原酶及相关酶的结构、功能、特性，有效地阐明藻类细胞对各种胁迫的适应性都具有重要的理论指导意义。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 球等鞭金藻I.galbana形态结构

1．2 球等鞭金藻的研究现状及应用前景

1．2．1 水产动物饵料

1．2．2 生产多不饱和脂肪酸(PUFAs)

1．2．3 抗肿瘤药物

1．2．4 球等鞭金藻在能源和污水处理方面的应用

1．3 生物柴油

1．3．1 生物柴油概述

1．3．2 生物柴油特性

1．3．3 微藻生物柴油

1．4 环境条件对球等鞭金藻的生长及生化成分的影响

1．4．1 氮、磷、硅等营养因子的影响

1．4．2 环境因素对微藻生长及油脂积累的影响

1．5 烯酰-ACP还原酶概述

1．5．1 烯酰-ACP还原酶的功能

1．5．2 烯酰-ACP还原酶的种类

1．5．3 烯酰-ACP还原酶的研究现状

1．6 本研究的目的及其意义

1．6．1 研究目的

1．6．2 研究意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株、质粒

2．1．2 酶与各种生化试剂

2．2 实验方法

2．2．1 球等鞭金藻的保存与培养

2．2．2 球等鞭金藻DNA和RNA的提取

2．2．3 cDNA合成

2．2．4 引物设计

2．2．5 5’RACE反应

2．2．6 3’RACE反应

2．2．7 IgENR DNA序列扩增

2．2．8 基因步移

2．2．9 PCR产物纯化

2．2．10 目的片段与质粒DNA的连接

2．2．11 感受态细胞的制备

2．2．12 质粒DNA向大肠杆菌中转化

2．2．13 重组质粒的PCR鉴定及测序

2．2．14 生物信息学分析

2．2．15 荧光定量

2．2．16 球等鞭金藻的尼罗红染色

2．2．17 球等鞭金藻总脂的提取

2．2．18 球等鞭金藻脂肪酸的甲酯化

2．2．19 GC-MS测定脂肪酸

2．2．20 脂肪酸结果分析

3 结果与分析

3．1 IgENR基因全长的获得

3．1．1 球等鞭金藻RNA提取结果

3．1．2 球等鞭金藻IgENR基因序列全长的获得

3．1．3 IgENR DNA序列克隆

3．1．4 IgENR基因步移

3．2 生物信息学分析IgENR基因序列

3．2．1 IgENR基因核酸序列与预测的氨基酸序列

3．2．2 IgENR基因内含子与外显子

3．2．3 球等鞭金藻IgENR蛋白质特性分析

3．2．4 球等鞭金藻IgENR蛋白质的亚细胞定位

3．2．5 IgENR蛋白的跨膜区预测分析

3．2．6 IgENR氨基酸序列的多序列比对

3．2．7 IgENR的系统进化树

3．3 荧光定量PCR分析不同条件下IgENR的表达

3．3．1 扩增产物特异性检测结果

3．3．2 球等鞭金藻IgENR基因在不同温度下的表达

3．3．3 球等鞭金藻IgENR基因在不同氮浓度下的表达

3．4 球等鞭金藻油脂含量

3．4．1 球等鞭金藻生长的标准曲线

3．4．2 微藻细胞尼罗红染色镜检结果

3．4．3 不同培养条件下细胞密度油脂动态积累检测

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况