特异性DNA甲基化谱在动脉粥样硬化性疾病早期诊断中的实验研究

摘要

背景：动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种由遗传和环境等多因素共同参与的慢性复杂性病变，其所致的心脑血管疾病是一种严重危害人类身体健康的常见病、多发病，发病率和死亡率居各类疾病之首。但AS的早期分子诊断标志物及方法尚未完全阐明。DNA甲基化是DNA基因碱基序列没有改变而功能发生变化，是除遗传学调控基因表达外又一重要调控方式，是联系遗传和环境因素的纽带；且DNA甲基化现象比临床症状出现更早，疾病未出现临床症状前DNA甲基化即已发生了典型改变，因此，DNA甲基化被认为是AS早期诊断的生物学标志物。但以往大多局限于对单个或少数基因甲基化的研究，而AS作为多因素复杂性疾病，其基因表型和疾病表型间的复杂关系并不能通过将单个基因的独立作用进行简单的加和来充分解释，仅依靠单个或少数基因的异常甲基化状况判断AS的发展状况是不准确的，因此，如能从多基因水平寻找出AS表遗传标志物，找到有效的早期诊断方法和干预手段，指导AS的靶向性治疗及潜在的干预靶点寻找，对提高人们生活水平和质量有不可估量的作用，产生可观的经济、社会效益，有广阔的推广应用和产业化前景。
　　目的：揭示AS发生发展过程中出现甲基化异常的AS相关基因，建立AS性疾病早期分子诊断特异性DNA甲基化谱，并同步研究AS发生发展中特异性DNA甲基化谱的早期风险评估及诊断作用，了解AS发生发展过程中甲基化异常的表遗传学机制。
　　方法：分别在NCBI和OMIM中检索关键词“动脉粥样硬化”，筛选出118个AS相关基因；然后，经UCSC和CpG Island Searcher在线软件分别分析基因启动子序列并预测CpG岛，遴选出富含CpG岛的基因38个；根据基因表达位置及其调控方式的差异，排除外周血中不表达及主要受基因多态性调控的10个基因；进一步根据甲基化数据库methDB的分析，并最终筛选出富含CpG的12个基因亚型展开重点研究。以年龄30-60岁AS宁夏人群为研究对象，选择2011年5月至2012年9月宁夏医科大学总医院心内科就诊和体检者。研究对象于清晨、空腹状态下抽取静脉血10 ml，当日由全自动生化分析仪完成临床生化指标甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的检测。经临床症状和血脂指标等检测，并经颈动脉多普勒超声确诊后，分为两组，每组各50例，提取AS患者和对照组DNA和RNA。提取后的DNA进行重亚硫酸盐修饰，巢氏降落式甲基化特异性PCR（ntMS-PCR）检测ABCA1、ACAT、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF、NFκB 12个基因的甲基化启动子区CPG岛甲基化的改变。结果显示ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1 和5-LO五个基因的甲基化程度在两组间差异显著(P<0.01)；统计分析后，选择特异性和敏感性较高的TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因建立AS特异性DNA甲基化谱，运用RT-PCR法检测其建谱基因的mRNA表达，探讨差异基因的DN A甲基化和基因表达的关系。另外收集临床上诊断为AS的病人和正常人，共100例，在实验一的基础上，并分析DNA甲基化谱（TIMP-1、ACAT1、ABCA1）中多个基因甲基化的改变，并与与颈动脉多普勒超声诊断相比，评价特异性DNA甲基化谱在动脉粥样硬化性疾病早期分子风险评估及诊断价值。
　　结果：在AS特异性甲基化谱分析中，候选的12个基因（ABCA1、ACAT、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF和NFκB）启动子区域 CpG岛甲基化状态分析发现，TIMP-1(P<0.01)、ACAT1(P<0.01)、ABCA1(P<0.01)、5-LO(P<0.05)和PPARα(P<0.05)这五个基因的DNA甲基化程度在两组之间有显著性差异，且TIMP-1、ACAT、ABCA1的灵敏度和特异度较好。联合检测TIMP-1、AC AT1、ABCA1的DNA甲基化程度，和颈动脉多普勒超声相比，灵敏度和特异度分别是88％、70%，一致性79%，这一结果显示了DNA甲基化谱具有AS风险评估中的价值。
　　结论：1. ACAT1、PPARα 、TIMP-1、ABCA1、5-LO DNA甲基化在对照组和AS组有显著差异，说明相关基因的DN A甲基化是AS早期的、频发的事件且甲基化改变对诊断AS有特异性。2. TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因甲基化改变对诊断AS有较好的特异度和灵敏度，可作为临床研究的备选分子生物学标志物。3.联合检测TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因，其甲基化异常状态具有动脉粥样硬化早期风险评估价值。

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前言

参考文献

材料与方法

1．实验仪器和材料

2.实验方法

3. 统计学处理

结果

1. 对照组和AS组中的多普勒超声检查结果

2. 对照组和AS组的血脂水平

3. AS相关基因的初步筛选

4. 基因组DNA质量

5. DNA甲基化水平显著改变的动脉粥样硬化相关基因

7. 建谱基因在两组中mRN A的表达

讨论

结论

参考文献

综述

综述参考文献

致谢

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