ETEC K99、987P抗体PPA-ELISA检测方法的建立及基因工程菌K88-K99高密度发酵工艺的研究

摘要

为了能够快速检测ETEC菌毛蛋白K99及测定其免疫效价，以纯化的大肠埃希菌K99菌毛蛋白为包被抗原，建立了检测大肠埃希菌K99IgG抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA的最适反应条件，即抗原包被的ELISA板4℃过夜，最适抗原包被浓度为4.94μg/mL，兔抗体稀释倍数为1∶50，猪抗体稀释倍数为1∶200，确定最佳封闭液为100g/L脱脂奶粉，最佳封闭时间为0.5h，血清反应时间为1h，二抗最适浓度梯度为1∶2000，反应时间为37℃0.5h，底物室温反应时间为37℃10min，阴阳性临界值兔血清为0.25、猪血清为0.35。
　　 以纯化的大肠埃希菌987P菌毛蛋白为包被抗原，建立了检测大肠埃希菌987PIgG抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA的最适反应条件，即抗原包被的ELISA板4℃过夜，最适抗原包被浓度为27.44μg/mL，自制兔抗血清稀释倍数为1∶10，猪抗体稀释倍数为1∶200，确定最佳封闭液为100g/L脱脂奶粉，最佳封闭时间为0.5h，血清反应时间为1.5h，二抗最适浓度梯度为1∶2000，反应时间为37℃0.5h，底物室温反应时间为37℃20min，阴阳性临界值兔血清为0∶37、猪血清为0.37。
　　 通过培养基LB、改良LB、改良LB+微量盐、改良Minca和2*YT+1％葡萄糖五种培养基进行筛选，设定培养基初始PH分别为6、6.5、7和7.5四个梯度进行蛋白表达，确定了最佳培养基初始PH=7;用全自动微生物生长仪每隔半个小时测定菌液的OD值，最终确定2*YT+1％的葡萄糖生长菌数较多，细菌生长速度快，PH=7时蛋白表达量较高，并且通过细菌生长曲线得出最佳诱导时机为2.5h～3h，诱导时间4h，溶氧量控制在30％，为ETEC大肠杆菌高密度发酵工艺的研究提供了基础数据和基因工程菌K88-99工业化生产创造了条件。

目录

声明

论文说明

摘要

1 前言

1．1 E.coli致病因子的研究进展

1．1．1 E.coli黏附素

1．1．2 肠毒素

1．1．3 毒力岛

1．1．4 重要的细菌抗原

1．2 仔猪腹泻性大肠杆菌基因工程疫苗及高密度发酵技术的研究进展

1．2．1 基因工程疫苗概述

1．2．2 肠毒素基因工程疫苗的研究

1．2．3 大肠埃希氏菌K88-K99双价基因工程疫苗

1．2．4 大肠杆菌高密度发酵的研究

1．2．5 免疫血清学实验技术

1．2．6 小结

2 材料及方法

2．1 ETEC菌毛蛋白K99抗体PPA-ELISA检测方法的建立

2．1．1 试剂及仪器

2．1．2 菌株及血清

2．1．3 K99菌毛蛋白的制备

2．1．4 酶标板均一性测定

2．1．5 PPA-ELISA反应条件优化

2．1．6 猪阳性血清最佳稀释倍数确定

2．1．7 CUT-OFF值的确定

2．1．8 特异性试验

2．1．9 敏感性试验

2．1．10 重复性试验

2．1．11 符合性试验

2．1．12 临床应用

2．2 ETEC菌毛蛋白987P抗体PPA-ELISA检测方法的建立

2．2．1 试剂及仪器

2．2．2 菌株及血清

2．2．3 987P菌毛的制备

2．2．4 酶标板均一性测定

2．2．5 PPA-ELISA反应条件优化

2．2．6 猪阳性血清最佳稀释倍数确定

2．2．7 CUT-OFF值的确定

2．2．8 特异性试验

2．2．9 敏感性试验

2．2．10 重复性试验

2．2．11 符合性试验

2．2．12 临床应用

2．3 ETEC基因工程菌K88-K99融合蛋白高密度发酵工艺的研究

2．3．1 试剂及仪器

2．3．2 菌株

2．3．3 培养基配制

2．3．4 菌株活化

2．3．5 发酵种子液的制备

2．3．6 培养基筛选

2．3．7 摇瓶发酵试验

2．3．8 培养基pH值的确定

2．3．9 诱导时机的确定

2．3．10 高密度发酵

2．3．11 菌落计数

2．3．12 蛋白可溶性分析

2．3．13 目的蛋白的定量

3 结果

3．1 ETEC菌毛蛋白K99抗体PPA-ELISA检测方法的建立

3．1．1 K99菌毛蛋白的纯化

3．1．2 酶标板均一性测定

3．1．3 PPA-ELISA反应条件的优化

3．1．4 CUT-OFF值的确定

3．1．5 特异性实验

3．1．6 敏感性试验‘

3．1．7 重复性试验

3．1．8 符合性试验

3．1．9 临床应用

3．2 ETEC菌毛蛋白987P抗体PPA-ELISA检测方法的建立

3．2．1 987P菌毛蛋白的纯化

3．2．2 制备987P兔抗血清

3．2．3 酶标板均一性测定

3．2．4 PPA-ELISA反应条件的优化

3．2．5 猪阳性血清最佳稀释度

3．2．6 CUT-OFF值确定

3．2．7 特异性试验

3．2．8 敏感性试验

3．2．9 重复性试验

3．2．10 符合性试验

3．2．11 临床应用

3．3 ETEC基因工程菌K88-K99融合蛋白高密度发酵工艺的研究

3．3．1 冻干菌种质量检测

3．3．2 确定培养基

3．3．3 2*YT+0.5％葡萄糖培养基表达蛋白情况

3．3．4 不同pH蛋白表达情况

3．3．5 诱导时机的确定

3．3．6 高密度发酵结果分析

3．3．7 细菌计数

3．3．8 蛋白可溶性分析

3．3．9 蛋白定量

4 讨论

4．1 ETEC菌毛蛋白K99抗体PPA-ELISA检测方法的建立

4．2 ETEC菌毛蛋白987P抗体PPA-ELISA检测方法的建立

4．3 ETEC基因工程菌K88-K99融合蛋白高密度发酵工艺的研究

5 结论

参考文献

致谢

所发表的文章