我国部分地区蛋鸡产气荚膜梭菌毒素型调查及恩拉霉素对产气荚膜梭菌抑菌作用研究

摘要

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，又称魏氏梭菌(Clostridium welchii)，是一种梭状芽孢菌属条件性致病菌，在自然界分布非常广，可引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症，同时也是人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一，该菌的致病因子是其所产生的外毒素。到目前为止，已发现的外毒素有12种(α、β、γ、η、δ、ε、ι、θ、κ、λ、μ和ν)之多，但起主要致病作用的毒素只有4种，即α、β、ε和ι，根据这4种主要致死性毒素与其抗毒素的中和试验，可将该菌分为A、B、C、D、E5个毒素型。本研究通过使用多重PCR对覆盖全国范围的14个省、市、自治区蛋鸡场样品进行检测了解全国各地养鸡场中产气荚膜梭菌流行状况，获取不同地区产气荚膜梭菌主要流行的毒素型，为后期疾病流行及调查备份重要资料。并通过与某公司的合作，了解恩拉霉素对产气荚膜梭菌的抑制特点，给药物的研发提供重要数据。本研究分为三个部分:
　　 规模化蛋鸡场产气荚膜梭菌的分离:
　　 通过从山东、河北、北京等覆盖全国的14省、市、自治区的31个规模化蛋鸡场进行粪便和肠道样品的采样对规模化蛋鸡场鸡群进行产气荚膜梭菌的流行现状普查，共采集390份新鲜粪便和肠道样品，选取疑似菌落进行纯化培养，按常规方法进行生化实验初步鉴定共分离得到产气荚膜梭菌40株，检出率为10.26％，低于国外相关报道的分离率。
　　 产气荚膜梭菌毒素型分析:
　　 参照已发表文献对α、β、ε、ι、β2和肠毒素六种毒素根据三步PCR检测体系分别对cpa、cpb2、etx、iap的四基因进行multi—PCR，及cpb和cpe的单基因PCR检测。最终得到其中一株扩增出196bp和325bp两条条带其余均只有325bp—条条带，因此得到只有一株C型菌其余39株均为A型菌。通过对产气荚膜梭菌毒素型的分析可以了解各地产气荚膜梭菌分布，为流行病学调查和诊断提供了重要依据。恩拉霉素对比抑菌实验:
　　 本实验主要使用某公司生产的恩拉霉素产品与同种产品不同批次生产的产品进行比较，对产气荚膜梭菌进行药敏实验，从而获得恩拉鼎对产气荚膜梭菌的抑菌特点，并通过不同时期产品进行对比，确定试验结果。通过实验得出恩拉鼎从0.01μg/ml便可以对产气荚膜梭菌进行较强的抑制，当达到0.1ug/ml浓度以后抑菌效果会出现降低现象，0.5ug/ml以后随着药物浓度增大抑菌效果重新增强，在实验室条件下呈现一个曲线抑菌效果，经过使用某公司提供的恩拉鼎与不同批次产品在实验室条件下对产气荚膜梭菌抑菌能力和特点基本相同，这为该产品的实际应用和进一步研发提供了重要数据。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 产气荚膜梭菌简介

1．1．1 产气荚膜梭菌主要毒素型

1．1．2 肠毒素的结构与功能

1．2 产气荚膜梭菌在我国的流行情况

1．3 产气荚膜梭菌对禽类的影响

1．4 产气荚膜梭菌流行病学研究的必要性

1．5 产气荚膜梭菌检测方法

1．5．1 血清中和方法

1．5．2 ELISA方法

1．5．3 反向间接胶乳凝集方法

1．5．4 间接免疫荧光法

1．5．5 PCR检测产气荚膜梭菌

1．6 恩拉霉素介绍

1．6．1 恩拉霉素结构

1．6．2 恩拉霉素作用机理

1．6．3 恩拉霉素生产应用效果

1．6．4 恩拉霉素使用注意事项

1．6．5 此研究现状

1．7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验样品

2．1．2 参考菌株

2．1．3 培养基

2．1．4 主要仪器、试剂

2．2 试验方法

2．2．1 主要溶液配制

2．2．2 产气荚膜梭菌的分离培养

2．2．3 Multi-PCR鉴定分离菌株的毒素型

2．2．4 恩拉霉素最小抑菌浓度(MIC)测定

2．2．5 恩拉鼎抑菌实验

3 结果与分析

3．1 粪便样品产气荚膜梭菌的直接分离结果

3．2 粪便样品使用FTG培养基增菌培养分离结果

3．3 产气荚膜梭菌革兰氏染色镜检结果

3．4 产气荚膜梭菌生化实验结果

3．5 产气荚膜梭菌α鉴定分离株结果

3．6 三步PCR检测产气荚膜梭菌分离株毒素型分析结果

3．6．1 α 、β2、ε、ι四种毒素基因多重PCR检测结果

3．6．2 产气荚膜梭菌的β、肠毒素基因单重PCR检测结果

3．6．3 多重PCR特异性检测

3．6．4 产气荚膜梭菌最终分离结果

3．7 恩拉霉素最小抑菌浓度(MIC)测定结果

3．8 恩拉霉素对比抑菌结果

3．8．1 恩拉霉素外观对比

3．8．2 MSD恩拉霉素对产气荚膜梭菌抑菌结果

3．8．3 GC Ⅰ恩拉霉素对产气荚膜梭菌抑菌结果

3．8．4 MSD、GC Ⅰ同培养基对比抑菌效果对比

4 讨论

4．1 产气荚膜梭菌的分离

4．2 多重PCR检测产气荚膜梭菌毒素型

4．3 恩拉霉素对产气荚膜梭菌抑制特点

5 结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

附图

致谢