高温胁迫下番茄Solexa转录组测序及LeCOR413-TM1基因克隆和功能分析

摘要

温度胁迫是影响番茄作物产量及地域分布的主要限制因子之一，通过基因工程手段提高植物的抗性，培育耐高温或耐低温番茄品种是有效缓减温度胁迫的重要途径之一。
　　本实验通过Solexa高通量测序，对高温胁迫处理前后的番茄植株进行转录组测序，分析了受高温胁迫上调和下调表达的基因，揭示了番茄高温胁迫下转录组水平的复杂的调控网络。同时，从Solexa测序下调的基因中筛选出一个番茄冷调节(Cold-regulated gene，COR)家族同源基因，并从番茄品种中蔬6号叶片中分离到该基因，命名为LeCOR413-TM1，对其序列特征、表达模式以及转基因烟草的抗逆生理功能进行了研究。主要结果如下:
　　(1)高温处理番茄植株，用Solexa技术进行序列测定，处理前后分别检测到4661314和4981634个有信号的探针，各包含了186280和226513个特异性标签。去除假阳性标签后，分别获得了4563284和4862014个清晰标签。通过比对番茄基因数据库，分别找到了3302958(72.38％)和3211809(66.06％)个匹配的标签。我们以log2值（变化倍数）＞2和＜-2、P-value值（统计学有效值）＜0.001、FDR（错误发生率）＜0.01作为筛选基因的标准，找到了284个上调基因和154个下调的基因，主要参与环境应答的有36个上调和28个下调基因，参与转录调控的有108个上调和36个下调基因，参与代谢的有53个上调和58个下调基因;其中未知基因约占18.9％。
　　(2)利用同源序列设计引物，通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到全长cDNA，命名为LeCOR413-TM1(AW034114)。该基因全长为726bp，开放阅读框663bp，编码221个氨基酸。qRT-PCR结果表明，LeCOR413-TM1在叶中表达量最高;同时，该基因的表达受4℃、PEG、ABA及强光诱导。
　　(3)将p35S-LeCOR413-TM1-GFP融合蛋白在烟草体中瞬时表达。通过Confocal观察到GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合，说明LeCOR413-TM1基因产物定位于叶绿体。
　　(4)将获得的LeCOR413-TM1基因与含有35S启动子的pBI121载体重组，构建了正义过表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，用PCR和qRT-PCR的方法对转基因烟草植株进一步检测，结果证明成功地获得了转正义的烟草植株。
　　(5)在低温(4℃)胁迫条件下，与野生型相比较，转基因烟草的种子萌发和幼苗的生长情况均好于野生型。这些结果表明，过表达LeCOR413-TM1提高了转基因烟草的抗低温能力。
　　(6)利用NBT和DAB染色及相对电导率的测定发现，在低温(4℃)胁迫条件下，与野生型相比较，转基因烟草能维持较低的O2·-和H2O2含量和细胞膜受伤害程度;正常条件下，野生型和转基因烟草的多相荧光诱导动力学曲线变化基本一致，受低温胁迫后(4℃)，转基因烟草的K点上升幅度明显低于野生型，即转基因烟草受到的光抑制较轻。