拟南芥两个胞质果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的新功能初探

摘要

果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(FBA)是一类重要的糖代谢酶，该酶既参与了糖酵解和糖异生过程，同时又参与了磷酸戊糖途径和卡尔文循环，对植物体正常的生命活动具有极其重要的作用。此外，动物和细菌中的研究还发现果糖-1，6-二磷酸醛缩酶能与细胞骨架结合，参与微管的聚合、细胞的内吞和膜泡运输。同时还参与了病原菌的侵染过程。但植物中关于果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的研究相对较落后。目前的研究发现主要集中于果糖-1，6-二磷酸醛缩酶能够影响植株的生长和生物量的积累，并参与植物体逆境胁迫下的响应。
　　 拟南芥基因组中含有8个果糖-1，6-二磷酸醛缩酶编码基因，但其生物学功能及作用机制尚不清楚。因此本研究以拟南芥为材料，在前期对果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因家族的系统进化和表达模式分析的基础上，对其中两个胞质定位的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因进行了初步功能分析，主要实验结果如下:
　　 (1)用AtFBA6基因的全长核苷酸序列构建超表达和GFP融合蛋白的载体，转化拟南芥后获得转基因株系，表达量检测说明转基因植株可用。
　　 (2)激光共聚焦扫描显微镜观察结果表明，AtFBA6编码的蛋白定位于胞质。
　　 (3)从SALK突变体库订购AtFBA6的T-DNA插入突变体(SALK014964C)。对fba6突变体和多个AtFBA6超表达转基因株系进行表型分析，发现在正常生长条件下，突变体与野生型没有明显差异，而超表达转基因株系比野生型生长速度加快，植株鲜重增加。
　　 (4)显微观察结果表明AtFBA6超表达株系中细胞的数目没有增加，但单个细胞体积明显增大。生化分析结果表明AtFBA6超表达株系中总糖和ATP含量高于野生型。说明，AtFBA6超表达后可以促进植物糖的合成和能量供应，使植株生长加快。
　　 (5)我们前期的研究发现AtFBA8在植物花中的表达量最高。表型分析发现AtFBA8两个T-DNA插入突变体fba8-1和fba8-2的果荚结实率明显低于野生型。
　　 (6)花形态分析表明，fba8-1和fba8-2突变体的花发育和花形态（包括花瓣、雄蕊、心皮的数目，花丝的长度以及柱头的发育）与野生型一致。fba8突变体与野生型拟南芥正反交结果表明fba8果荚结实率降低是由于雄配子体在有性生殖过程中异常导致的。
　　 (7) Alexander染色和DAPI染色结果表明fba8突变体的雄配子体花粉的发育、成熟和活性均是正常的。
　　 (8)花粉体外萌发实验结果表明，fba8突变体的花粉萌发率降低。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 植物果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的研究进展

1．1．1 植物体中果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的类型

1．1．2 植物果糖-1，6-二磷酸醛缩酶与植物激素的关系

1．1．3 植物中果糖-1，6-二磷酸醛缩酶与胁迫响应的关系

1．2 植物体果糖-1，6-二磷酸醛缩酶对光合作用的影响

1．3 果糖-1，6-二磷酸醛缩酶功能的多样性

1．3．1 果糖-1，6-二磷酸醛缩酶与V-ATP酶的相互作用

1．3．2 果糖-1，6-二磷酸醛缩酶与线粒体膜的相互作用

1．3．3 果糖-1，6-二磷酸醛缩酶与细胞骨架的相互作用

1．3．4 果糖-1，6-二磷酸醛缩酶与病原菌的致病力

1．4 本实验的目的意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 酶与各种生化试剂

2．1．4 实验中用的引物

2．2 实验方法

2．2．1 植物基因组的提取与纯化

2．2．2 PCR鉴定突变体纯合植株

2．2．3 载体构建

2．2．4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．5 大肠杆菌中质粒的提取

2．2．6 农杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．7 拟南芥的转化及转基因拟南芥的鉴定

2．2．8 RNA的提取纯化与反转录

2．2．9 半定量RT-PCR(Semiquantitative RT-PCR)

2．2．10 实时定量反转录PCR

2．2．11 拟南芥原生质体的制备

2．2．12 拟南芥总糖含量的测定

2．2．13 体外拟南芥花粉萌发和观察

2．2．14 叶片细胞的铺展和透明化处理

2．2．15 ATP含量测定原理及方法

2．2．16 激光共聚焦扫描显微镜观察GFP定位

2．2．17 花药的Alexander染色

2．2．18 花粉细胞核的DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)染色

3 结果与分析

3．1 GFP融合蛋白转基因植株的获得和亚细胞定位

3．1．1 GFP融合蛋白转基因植株的获得

3．1．2 AtFBA6的亚细胞定位

3．2 AtFBA6 T-DNA突变体的获得和表达分析

3．3 转基因株系的获得和表型鉴定

3．3．1 AtFBA6的超表达转基因株系的获得及表达量鉴定

3．3．2 超表达转基因株系的表型鉴定

3．4 AtFBA6促进拟南芥生长的机制探究

3．4．1 AtFBA6超表达转基因植株的细胞体积增大

3．4．2 AtFBA6超表达转基因植株代谢水平提高

3．5 AtFBA8 T-DNA突变体的获得和表型分析

3．5．1 AtFBA8突变体的鉴定和表达量分析

3．5．2 AtFBA8突变体的表型分析

3．6 AtFBA8基因功能的探究

3．6．1 AtFBA8基因表达量的下调并未影响花器官的正常发育

3．6．2 花粉的发育和活力的鉴定

3．6．3 AtFBA8基因参与了花粉的萌发过程

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况