侧孢短牙孢杆菌AMCC100017的分离鉴定、生防潜力及其发酵条件的系统优化

摘要

从土壤中选择性地分离、筛选和鉴定具有特定生防效果的菌株，为进一步开发利用具有良好定殖能力的生防菌株奠定基础。本研究从山东泰安农田、果园、菜地等各种类型土壤中取样，经80℃水浴处理样品10min，以串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌作为靶标，利用平板对峙实验筛选拮抗菌并评价其拮抗性能，最终得到5株具有较好生防效果的产芽孢细菌，对其中一株拮抗效果最佳的细菌，进行了形态特征、生理生化特性、16S rDNA序列测定及GenBank序列相似性分析的分类鉴定工作，鉴定结果为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus），保藏编号AMCC100017。通过福林酚法测定该菌株的蛋白酶活力，分光光度法测定纤维素酶活力、几丁质酶活力和果胶酶活力，结果表明该菌株产蛋白酶活性较高，发酵6d酶活力达到1687.2U/mL。抗菌谱试验表明该菌株对多种植物病原真菌均有较强的拮抗作用，尤其是对镰刀菌属和丝核菌属致病菌，拮抗效果明显。
　　侧孢短芽孢杆菌能产生多种活性物质，具有抗菌、杀线虫和免疫调节等广泛有效的应用潜力。本研究筛选出的侧孢短芽孢杆菌AMCC100017，在作物真菌病害尤其是小麦纹枯病、果树病害尤其是苹果再植障碍克服、线虫生物防治等方面，都有着较好的开发和利用潜力。侧孢短芽孢杆菌发酵菌数和芽孢形成数偏低是其生产应用中的瓶颈。本研究对侧孢短芽孢杆菌AMCC100017菌株进行液体发酵试验，通过单因素试验、Plackett-Burman法及响应面法对发酵活菌数和产芽孢数进行了系统优化。结果表明，发酵最佳碳源、氮源和无机盐分别是玉米粉、鱼蛋白胨和硫酸镁，最适条件是温度35℃、初始pH值7.5、装液量40mL/250mL、接种量2％，菌体发酵时间为24h，产芽孢发酵时间为48h。通过Plackett-Burman试验筛选出影响菌体发酵的显著因素分别为温度、装液量和接种量，影响芽孢生成的显著因素是碳源、温度和发酵时间。响应面法优化得最佳温度为34℃、装液量39mL/250mL、接种量2％、玉米粉59g/L、产芽孢发酵时间48h。验证试验最高活菌数为6.2×109CFU/mL，最高芽孢数为2.5×109CFU/mL。
　　微生物产品从实验室到工业生产的开发过程中，需要逐级放大培养（依次经过小试、中试、生产）。本研究在侧孢短芽孢杆菌AMCC100017摇瓶发酵试验的基础上，分别对其进行5L和20L的小试试验。结果表明，发酵罐参数设置为转速250r/min、通气量4m3/(m3·min)时，发酵效果最好，活菌数最高能达到2.8×1010CFU/mL。