花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT9)表达载体构建及转化研究

摘要

花生是我国重要的油料作物之一，提高含油量对花生育种具有重要意义。植物贮藏油脂主要以三酰甘油(TAG)的形式存在于种子中，是由1分子甘油与3分子脂肪酸通过酯键相结合而成，是大多数生物中贮存能量和供给能量的主要形式。本研究构建了花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因（GPAT9)的表达载体，并利用农杆菌介导途径将其导入花生栽培种，获得GPAT9过表达的转基因植株。
　　主要研究结果如下:
　　(1)花生GPAT9基因过表达载体的构建
　　利用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切重组质粒pEASY-GPAT9和载体质粒pGBVE，分别进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA和载体DNA片段，用T4DNA连接酶将目的DNA片段与载体pG VE大片段连接，将重组DNA转化至大肠杆菌中，DNA测序结果表明携带AhGPAT9的过表达载体pGBV-G PA T9构建成功，将其转入农杆菌LBA4404。
　　(2)花生GPAT9基因反义表达载体的构建
　　为了将目的基因GPAT9反向插入表达载体中，在其上下游引物中引入NotⅠ和BamHⅠ识别序列，以pGBV-GPAT9为模板经PCR扩增，获得两端带有NotⅠ和BamHⅠ酶切位点的目的基因，命名为RGPAT9，与载体pEASY-T1连接获得pEASY-RGPAT9，重组质粒pEASY-RGPAT9转入大肠杆菌繁殖后，利用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切，回收目的基因片段，与植物表达载体质粒pGBVE大片段连接，将重组DNA转化至大肠杆菌中，DNA测序结果表明携带AhGPAT9的反义表达载体pGB V-RGPAT9构建成功，将其转入农杆菌LBA4404。
　　(3)花生GPAT9基因的遗传转化
　　以花生栽培种丰花2号的胚小叶为外植体，通过农杆菌介导法，将GPAT9基因转入花生中，共侵染外植体26703个，获得1178株再生苗，筛选得到151株抗PPT的试管苗，PCR检测获得阳性苗100株，其中27株生根，经扩繁炼苗后移栽大田。
　　(4)花生反义GPAT9基因的遗传转化
　　以丰花2号的胚小叶为外植体，通过农杆菌介导法，将反义GPAT9基因转入花生中，共侵染外植体6780个，并获得5株再生茁。