猪TLR3基因及SP-C、SP-D基因启动子功能分析

摘要

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的一种病毒性传染病。PRRS导致妊娠母猪严重繁殖障碍，仔猪高死亡率以及各年龄段尤其是仔猪的呼吸道疾病。有研究表明我国优良地方品种大蒲莲猪对蓝耳病的抗性比西方猪种杜长大杂交猪高。我们分析了感染PRRSV对模式识别受体TLR3（Toll-like receptor3TLR3）mRNA表达的影响;对TLR3基因启动子区进行了克隆;对大蒲莲猪、莱芜猪、长白猪、杜洛克猪四个品种301个样品启动子区的SNPs（Single nucleotide polymorphisms）进行了检测;对TLR3基因的调控进行了初步分析，结果表明:
　　1.通过NCBI数据库将猪的TLR3基因氨基酸序列与该基因其他物种氨基酸序列进行比对，发现其和哺乳动物（包括人、猴、马、小鼠、狗、绵羊、牛、黑猩猩）的同源性较高，其次是鸡，而与斑马鱼的同源性较低。
　　2.利用RT-PCR进行表达谱分析，结果显示，TLR3基因在肝、肾、胃、脾、脾中均有明显的表达，而在心脏、子宫、淋巴结、大脑、肌肉、大肠、小肠和肺中有弱表达，在小脑、扁桃体中几乎检测不到其表达。
　　3.利用荧光定量PCR分析了大蒲莲猪及杜大长杂交猪感染PRRSV前后肺脏组织中模式识别受体TLR3的mRNA表达情况，发现TLR3基因在大蒲莲猪和杜大长杂交猪的表达上存在显著差异(P=0.0351)。攻毒前后，大蒲莲猪表达量均高于杜大长杂交猪。攻毒对于两种猪的影响不同，大蒲莲猪在攻毒后TLR3 mRNA表达量升高，杜大长杂交猪在攻毒后表达量下降。
　　4.分别用内切酶酶切法和PCR法构建不同长度的载体，通过细胞转染技术，利用双荧光素酶报告系统检测不同长度载体的表达情况，发现启动子长度在2.9 kb～2.1 kb和1.6 kb～0.6 kb是调控猪TLR3基因表达水平的重要区段。
　　5.TLR3基因的5'调控区转录起始位点上游-2603 bp～-2177 bp处有增强转录的功能(P＜0.001)，通过软件预测在-2170 bp处存在转录因子AP-1结合位点，并发现在此处存在A/C多态，并且由A→C突变引起转录因子c-Ets-的结合。定点突变TLR3基因-2170位点(A→C）改变c-Ets-的结合位点，突变型mutPRE的荧光素酶活性升高，但是不显著。
　　6.检测70头大蒲莲猪、48头莱芜猪、119头长白猪、64头杜洛克猪的重要调控区-2952 bp～-2177 bp的SNPs，在本地猪品种中CC型和AC型为优势基因型。西方商品猪的AA型为优势基因型。以上四种猪都不符合哈代温伯格平衡(P＜0.05)。
　　肺泡表面活性物质(Pulmonary Surfactant，PS)，是由Ⅱ型肺泡细胞分泌的，能与表面活性物质蛋白特异性结合。它是一种由磷脂、中性脂肪和特异性蛋白组成的复合物，对于降低肺泡表面张力、维持肺的顺应性起重要作用。我们寻找并获得了表面活性蛋白SP-C、SP-D基因启动子，并证明其在肺组织中特异性表达，结果如下:
　　1.构建了猪肺泡表面活性物质SP-C基因红色荧光蛋白表达载体，在肺组织中检测到红色荧光蛋白表达，而肌肉(C2C12)、脂肪(3T3-L1)等组织细胞中检测不到荧光蛋白表达，因此表明SP-C基因启动子只有在肺组织中特异性表达。
　　2.构建了猪肺泡表面活性物质SP-D基因红色荧光蛋白表达载体，在肺组织中检测到红色荧光蛋白表达，而肌肉(C2C12)、脂肪(3T3-L1)等组织细胞中检测不到荧光蛋白表达，因此表明SP-D基因启动子只有在肺组织中特异性表达。
　　综上所述，本研究初步表明TLR3基因的差异表达可能与大蒲莲猪对PRRS的抗性有关，并对TLR3基因的转录调控进行了分析，找到了重要的调控基因表达的元件;通过对不同猪种的TLR3基因启动子重要调控区测序分析，发现本地猪中和西方猪种有不同的SNPs;构建了构建了猪肺泡表面活性物质SP-C、SP-D基因红色荧光蛋白表达载体，验证了其在肺组织中特异性表达。