水貂多重感染的病原学分析及绿脓杆菌松花粉多糖佐剂灭活苗的研制

摘要

近几年，由多种病原共作用引起的水貂多重感染频繁出现，其发病原因复杂，临床症状不典型，给水貂疫病的预防和治疗带来极大的困难，也是制约当前水貂养殖业发展的关键因素。所以，本研究对实验室2010年3月至2014年2月接诊的山东地区的241份发病貂和病死貂进行了病原学检测和鉴定，并对主要病原菌绿脓杆菌的生物学特性做了进一步研究，制备了以松花粉多糖为佐剂的全菌体灭活苗。
　　研究内容包括以下三个部分:
　　第一部分水貂多重感染的病原学分析
　　为了掌握引起水貂多重感染的主要病原及其特点，本研究分别从细菌性病原和病毒性病原两个方面对接诊的病死貂进行了病原学的分离鉴定。细菌性病原主要是通过染色镜检、分离培养、生化试验和16SrRNA基因序列同源性分析来进行分离鉴定;病毒性病原则主要通过鸡胚接种，以及对主要病毒的特异性PCR产物进行序列进化分析等方法进行分离鉴定。结果表明山东地区引起水貂发病的主要病原有:犬瘟热病毒(25.3％)、细小病毒(25.3％)、阿留申病毒(19.1％)、绿脓杆菌(49.0％)、克雷伯氏菌(19.9％)、大肠杆菌(11.2％)、奇异变形杆菌(8.3％)、以及巴氏杆菌(5.0％)和肺炎双球菌(2.5％)。对主要病原进行系统性统计分析后发现山东地区水貂感染主要以病原的单独感染(46.0％)和二重感染(44.4％)为主，三重感染(7.9％)次之，四重感染(1.24％)和五重感染(0.41％)较少。
　　第二部分主要病原绿脓杆菌的生物学特性分析
　　从上述病死貂的病原学检测结果可知，绿脓杆菌是引起山东地区水貂多重感染的主要病原菌。为了迸一步了解其生物学特性，本研究对其进行了免疫型鉴定，以确定主要流行菌株的免疫型，并对其进行了药物敏感性检测，来确定各免疫型菌株对药物敏感性的差异及其敏感药物，还对各免疫型菌株的LD50进行了测定，来比较各免疫型菌株的毒力强弱。结果显示:118株绿脓杆菌分为3种免疫型:G型(89/118)、B型(21/118)和Ⅰ型(3/118);118株绿脓杆菌的药物敏感性试验结果显示，受试的12种常用抗菌药物中，对氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素和阿米卡星的敏感性较高;对阿莫西林、林可霉素和利福平耐药，而且对抗生素的敏感性与菌株的免疫型无明显关系;经动物试验证明，3种免疫型菌株毒力均不同，B型和Ⅰ型菌株毒力均较G型弱，G、B和Ⅰ免疫型菌株的LD50分别为:8×106 cfu、4.5×107 cfu、2.5×108 cfu。
　　第三部分绿脓杆菌松花粉多糖佐剂灭活苗的研制
　　从以上试验结果可知，G免疫型绿脓杆菌是引起水貂多重感染的主要病原，本实验室多年的研究结果显示，松花粉多糖具有很好的免疫调节和杀菌消毒作用。所以，本研究以松花粉多糖为佐剂，制备了G免疫型绿脓杆菌的全菌体灭活苗。试验将24只7周龄清洁级小白鼠，均分为3组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，Ⅰ组注射绿脓杆菌全菌体白油司班佐剂灭活苗;Ⅱ组注射添加松花粉多糖佐剂的绿脓杆菌全菌体灭活苗;Ⅲ组注射相同剂量的生理盐水。在免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d，分别对三组实验小鼠进行采样，用建立的ELISA方法检测采集的血清抗体效价，用全血分析法来检测淋巴细胞比率，用MTT法来检测外周血T淋巴细胞的转化率，用IL-2 ELISA试剂盒来检测IL-2的含量。结果显示:松花粉多糖佐剂绿脓杆菌全菌体灭活苗安全性良好，最佳免疫剂量为0.3ml，免疫保护率为90％，Ⅱ组各免疫指标均显著高于其他两组(P＜0.05)，表明本研究制备的松花粉多糖佐剂绿脓杆菌全菌体灭活苗对G型绿脓杆菌流行菌株具有很好的预防作用。