疏绵状嗜热丝孢菌突变体的筛选及蛋白激酶基因的过量表达

摘要

疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的嗜热真菌，是真核生物中生长上限温度最高的一种真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，并进行了真核表达，使得该菌种在工、农业生产和微生物研究中的作用越来越大。目前，对该嗜热菌感受和传导信号的机制尚不清楚。蛋白激酶基因pspk是我们从疏绵状嗜热丝孢菌中分离得到的一种新的蛋白激酶基因，其具体的功能尚需进行研究分析。通过遗传转化，向菌株基因组随机插入外源质粒DNA，构建该菌的突变体，对探索该菌的嗜热性机制具有重要意义。
　　本实验室利用农杆菌介导的转化法已成功建立了疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化系统，为研究基因的功能，分离功能基因提供了重要的手段，也为外源基因在其体内的表达提供了有效地途径。另外，利用亚细胞定位的方法，将该基因与GFP基因的融合表达载体pROKⅡ-GFP-pspk转化至洋葱表皮细胞并使其进行表达，在荧光显微镜下观察到绿色荧光出现在细胞核的位置，推测该蛋白激酶在洋葱表皮亚细胞定位的部位为细胞核。首先利用已成功构建的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化系统，通过农杆菌介导法筛选大量突变体，获得多株表型各异的突变体。这些突变体在菌落形态、颜色、产孢量等方面与野生菌株具有明显差异。这就为研究基因的功能，分离功能基因提供了材料，为探索该嗜热菌的耐热机制提供材料。本实验以疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶为研究对象，构建了其表达载体pROKⅡ-hph-pspk，并对本实验室已成功构建的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化系统进行优化。最终确定农杆菌菌株LBA4404在孢子萌发4.5h，孢子浓度为5×106个/皿，共培养时AS浓度为250μmol/L时，表达载体的转化效率达到最高。利用荧光定量技术，确定蛋白激酶基因pspk在转化菌株中的表达量是野生菌株的1.729倍，证明获得了蛋白激酶基因的过量表达的菌株。对得到的过量表达菌株进行生物表型分析，结果发现过量表达的菌株具有一致的生物表型特征，且其耐热性比野生菌株明显降低。通过以上研究初步推测蛋白激酶基因pspk可能与菌体的耐热功能相关，有助于从分子水平上了解疏绵状嗜热丝孢菌的生理特性，对于该基因功能的研究提供了依据和参考。