多重PCR检测牛肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的研究

摘要

食品安全已经成为全世界共同关注的公共卫生问题。在各种食品安全事件中，由细菌引起的食源性疾病最多，涉及人数最广。沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157∶H7被认为是牛肉中最重要的三种食源性致病菌。可靠的检测技术是确定食物中病原菌的先决条件。传统培养法操作繁琐（富集、分离、鉴定），检测时间较长，已经不能满足食品中致病菌快速灵敏检测的需要，以核酸为基础的多重PCR是一种快速、高灵敏度、特异性较强的检测方法，能同时检测多种食源性致病菌，有着广泛的应用前景。本文对多重PCR法检测牛肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157∶H7三种致病菌进行了研究。
　　本研究通过预实验筛选出种或属间特异性引物，并对其进行特异性检测。选用广泛存在于沙门菌属的侵袭蛋白基因invA作为检测沙门菌属的特异性基因;选用hlyA基因作为单增李斯特菌的毒力标志基因;选用大肠杆菌O157的O抗原基因(rfbE)和鞭毛抗原基因(flic），建立了同时检测三种食源性致病菌的多重PCR方法。在引物特异性实验中，四对引物分别扩增出大小为284 bp、456 bp、625 bp、812 bp的条带。各目的基因及引物间没有干扰，而其它非靶菌没有非特异性扩增现象，证明引物具有很高的特异性。
　　对多重PCR体系中的Taq酶、dNTP、引物浓度、Mg2+和退火温度进行优化，最终确定多重PCR反应体系为25μL:Mg2+4 mmol/L，dNTP0.4 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，1μLDNA模板，沙门氏菌的引物终浓度为0.2μmol/L，单增李斯特菌引物终浓度为0.1μmol/L，大肠杆菌O157∶H7引物终浓度为1μmol/L(flic)和0.3μmol/L(rfbE)，剩下的用无菌水补至25μL。多重PCR扩增程序为:95℃预变性30 s;95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环;最后72℃延伸7 min。在最佳实验条件下，多重PCR同时检测三种食源性致病菌，沙门氏菌和单增李斯特菌灵敏度为101CFU/mL，大肠杆菌O157∶H7灵敏度为102 CFU/mL;人工污染牛肉样品经18h富集培养后，沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7的检出限为100 CFU/g，单增李斯特菌的检出限为102 CFU/g。
　　通过比较试剂盒法、酚氯仿法和直接水煮法提取人工污染牛肉中三种致病菌的DNA，由电泳结果可知，试剂盒法的DNA提取效果明显优于酚氯仿法、直接水煮法。对比TSB和LB两种增菌培养基的增菌效果，选出使三种目标致病菌同时增菌的培养基。用LB增菌培养基进行前增菌，最低可同时检出102CFU/g的三种致病，用TSB增菌培养基进行前增菌，最低可同时检出103CFU/g的三种致病。因此，选用LB作为三种致病菌的通用增菌培养基。
　　对实际样品进行检测，并与国标法进行对比，结果表明，采用多重PCR方法简单、快速，能同时检测出牛肉中的一种或多种致病菌，具有较高的灵敏性、特异性和符合率。本研究建立的检测牛肉样品中的沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法，为这三种病原菌的控制奠定了一定的基础。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 食源性致病菌与食品安全

1．2 食源性致病菌简介

1．2．1 沙门氏菌

1．2．2 单增李斯特菌

1．2．3 大肠杆菌O157:H7

1．3 致病微生物快速检测技术的研究现状

1．3．1 以免疫学为基础的检测方法

1．3．2 分子生物学检测技术

1．4 本研究的目的及意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 主要培养基和试剂

2．2 试验方法

2．2．1 菌株培养

2．2．2 菌体DNA的提取

2．2．3 特异性基因的选择及多重PCR引物筛选

2．2．4 多重PCR体系优化

2．2．5 多重PCR反应产物检测

2．2．6 多重PCR特异性检测

2．2．7 多重PCR灵敏度检测

2．2．8 人工污染牛肉中三种致病菌DNA提取方法比较

2．2．9 不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比

2．2．10 人工污染牛肉的检出限

2．2．11 实际样品检测

3 结果与分析

3．1 多重PCR反应条件优化

3．2 多重PCR特异性评价

3．3 多重PCR检测菌体灵敏度

3．3．1 多重PCR检测单一致病菌的灵敏度

3．3．2 多重PCR同时检测三种致病菌的灵敏度

3．4 人工污染牛肉中三种致病菌DNA提取方法比较

3．5 对比不同增菌培养基的增菌效果

3．6 人工污染牛肉的检出限

3．6．1 多重PCR检测人工污染牛肉中单一致病菌

3．6．2 多重PCR同时检测人工污染牛肉中三种致病菌的检出限

3．6．3 多重PCR检测经富集培养的人工污染牛肉中三种致病菌的检出限

3．7 对实际样品的检测

4 讨论

4．1 靶基因的选择与多重PCR反应体系优化

4．2 多重PCR的抑制剂

4．3 增菌液的选择

4．4 与国标检测方法的比较

5 结论

6 创新点

参考文献

致谢