糖尿病诱发剂与化疗药物对家蚕的生理效应及BBXⅡ降血糖作用研究

摘要

以家蚕作为药物筛选、病理学、毒理学等试验的模式动物具有诸多优势，是一个很有意义的研究领域，但是国内外尚未有以家蚕作为糖尿病模型和化疗药物筛选模型的研究报道。本文利用生物化学、分子生物学、细胞学、药理学等研究手段，探讨了糖尿病诱发剂四氧嘧啶和链脲菌素以及化疗模药环磷酰胺对家蚕的生理效应;采用原核表达系统和改良的纯化技术获得了家蚕素Ⅱ(bombyxin-Ⅱ，BBXⅡ)的纯品，试验比较了BBXⅡ和胰岛素对家蚕和小鼠的降血糖作用和生物效应。本研究旨在为建立家蚕糖尿病模型和化疗药物筛选模型、开发BBXⅡ降血糖药物提供理论帮助。主要试验结果如下:
　　1.给予家蚕幼虫注射适宜剂量的四氧嘧啶和链脲菌素，均会在一定时间内引起血液中海藻糖含量显著升高，同时海藻糖酶活性显著降低，与其对高等动物的作用相似，证明利用糖尿病诱发剂能建立高血糖模型家蚕。四氧嘧啶和链脲菌素还引起家蚕脱水、提前入眠、三眠蚕、眠蚕脱肛（蜕皮异常）、产生不滞育卵等现象，同时也表现出不同程度的中毒症状，说明糖尿病诱发剂对调控家蚕代谢和发育的内分泌系统的功能具有广泛影响，进而影响蚕的水分代谢、眠性和化性变化。
　　2.四氧嘧啶和链脲菌素对家蚕BBXⅡ基因和PTTH基因的表达具有显著影响，其中两种药剂对PTTH基因表达及四氧嘧啶对BBXⅡ基因表达的影响因发育时期、药剂种类和剂量不同而异，但链脲菌素对BBXⅡ基因的表达在一定时间内均表现出显著的抑制作用。四氧嘧啶和链脲菌素是通过特异性损伤BBXⅡ分泌细胞而引起家蚕高血糖，还是由于其他原因引起血糖升高及生长发育、眠性和化性变化的，还有待于进一步研究。
　　3.从家蚕头部mRNA中经过反转录获得BBXⅡ基因的cDNA，并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ，经过IPTG诱导，使BBXⅡ获得了大量表达，进一步用HisTrapHP亲和层析，成功得到大量纯化的BBXⅡ。为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究奠定了基础。
　　4.利用纯化的BBXⅡ制备了BBXⅡ的兔多克隆抗体。对家蚕戊3-己2期胚胎及家蚕幼虫脑-咽侧体联合体进行了BBXⅡ抗体染色，但均未获得预期的对BBX分泌细胞的特异性染色结果，不过发现该抗体能够对胚胎期的蜕皮腺和丝腺进行特异性染色，其原因有待于进一步研究。BBXⅡ抗体可以作为胚胎期特异性识别蜕皮腺和丝腺的有效试剂。
　　5.研究比较了BBXⅡ和人胰岛素的降血糖作用。结果证明，无论对正常饲养的家蚕幼虫、饥饿幼虫或注射糖尿病诱发剂的幼虫，注射BBXⅡ后均在一定时间内引起血液中海藻糖含量显著降低，海藻糖酶活性升高。对BBXⅡ和胰岛素的降血糖作用比较发现，无论对正常饲养的小鼠，还是利用链脲菌素诱导的糖尿病小鼠，注射BBXⅡ的降血糖效果均与胰岛素相近，并表现出一定的剂量依赖性。另外还发现，给家蚕注射人的胰岛素，也能极显著地降低家蚕的血糖，并显著提高血液中海藻糖酶的活性。说明家蚕的BBXⅡ与人的胰岛素无论对家蚕还是对哺乳动物均具有相似的调节血糖的生理功能，它们不仅在结构上相似，而且在生理作用上的进化也是相似和保守的。本试验不仅证明了家蚕是一种理想的胰岛素类药物的试验动物，为今后开展胰岛素类药理学和糖尿病病理学研究提供了一条更加简单的途径，而且为开发BBX新型降血糖药物奠定了重要基础。
　　6.研究了化疗模药环磷酰胺对家蚕的生理效应，发现该药物在低剂量时对家蚕血球密度影响不大，甚至有增加血球密度的趋势，但达到一定剂量后能有效抑制家蚕血球的增殖，降低血球密度，而且还能改变不同类型血球的比例。另外还发现，环磷酰胺能够显著抑制家蚕精母细胞的减数分裂和精子变形成熟过程，说明其能抑制家蚕的有丝分裂和减数分裂过程。本研究证明了环磷酰胺对低等动物家蚕的细胞分裂和增殖的抑制作用与在高等动物中的作用相同或相似，因此，家蚕有望成为环磷酰胺类似化疗药物、免疫抑制药物和不育模型药物的试验动物。