鸽毛滴虫粘附蛋白AP65的克隆、鉴定及表面定位

摘要

鸽源禽毛滴虫，简称鸽毛滴虫，是一种侵害鸽消化道上段的鞭毛原虫，从而引起鸽毛滴虫病，亦称为“鸽癀”。鸽毛滴虫可感染所有品种和月龄的鸽子，其中对幼鸽危害最大。鸽毛滴虫病的特征是在鸽口腔、食道、嗉囊、前胃出现坏死性溃疡，常造成患鸽呼吸道和上消化道梗阻，妨碍正常呼吸和进食，继而引发呼吸困难和饥饿，严重时造成宿主死亡。鸽毛滴虫病是一种全球性疾病，具有高发性和广泛流行性。药物治疗鸽毛滴虫病有副作用，而且易产生抗药虫株。目前，亟需寻找安全有效的治疗方法，而致病机制相关分子的研究就成为未来重要的研究方向，具有重要意义。对粘膜微生物致病菌而言，粘附宿主细胞是至关重要的过程。只有粘附于宿主细胞，才能进行物理损伤、侵袭等一系列致病过程。粘附蛋白AP65是一种重要的滴虫毒力基因，在多种粘附蛋白中有突出的作用。鸽毛滴虫作为一种粘膜寄生虫，粘附作用可能是其重要特性，AP65也可能是其重要粘附蛋白。鸽毛滴虫潜在的表面毒力因子的探究，将为鸽毛滴虫致病机制和基因工程疫苗的研究奠定分子基础，为有效防止鸽毛滴虫病提供理论依据。
　　本试验具体分为以下4部分:
　　1.鸽毛滴虫AP65序列的克隆测序
　　本研究根据已知的阴道毛滴虫AP65三个基因型序列设计引物，克隆获得鸽毛滴虫AP65部分序列，结合5'RACE PCR和3'RACE PCR获取鸽毛滴虫AP65两端未知序列。通过试验和拼接分析获得两个基因型TgAP65-1(1766bp)、TgAP65-2(1759bp)，ORF长1704bp，编码567个AA，上传至GenBank获得序列号KJ721787、KJ721788。
　　2.鸽毛滴虫AP65的序列分析
　　对两个基因型进行序列比对发现，两者核酸同源性为94.22％，AA同源性达95.6％，并且差异主要存在于5'端。同时，对鸽毛滴虫AP65和阴道毛滴虫AP65各基因型的同源性进行了分析，同源性可达90.0％左右，同阴道毛滴虫苹果酸脱氢酶和氢化酶体苹果酸酶高同源(80％)。鸽毛滴虫TgAP65-1、TgAP65-2分别编码一个大小为63057.81Da、63042.74Da的蛋白质，pI分别为8.15、8.48。通过生物信息学软件对氨基酸序列进行分析预测，并结合已知阴道毛滴虫AP65结构功能信息比较，我们发现鸽毛滴虫AP65有短信号肽、无GPI、多个蛋白结合位点、两个苹果酸酶域，分别位于88-278，280-533位置。
　　3.鸽毛滴虫TgAP65-2重组蛋白多克隆抗体的制备
　　构建重组质粒pPIC9.0k-TgAP65-2，并采用氯化锂转染法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中，甲醇诱导表达，并用Ni柱纯化。经Western-blot鉴定表达的重组蛋白大小约为65KDa，与理论值相符。将纯化后的重组鸽毛滴虫AP65蛋白三次免疫BALB/c小鼠进行多克隆抗体的制备。通过间接ELISA方法测定抗鸽毛滴虫AP65抗体的效价后，将分离的小鼠血清作为多克隆抗体使用。
　　4.鸽毛滴虫自然表达AP65的鉴定及虫体表面定位
　　裂解虫体进行SDS-PAGE和Western-blot对鸽毛滴虫自然表达的AP65进行鉴定，结果显示AP65为虫体蛋白。通过间接免疫荧光检测试验对虫体自然表达的AP65进行虫体表面定位，荧光显微镜下可见虫体表面及鞭毛上都有荧光，但荧光较弱。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 鸽毛滴虫的病原学

1．1．1 病原体

1．1．2 流行病学

1．1．3 发病机理

1．1．4 病理变化及临床症状

1．1．5 鸽毛滴虫病诊断与防治

1．2 滴虫粘附作用及粘附蛋白的研究

1．2．1 粘附作用

1．2．2 粘附蛋白

1．2．3 铁对粘附蛋白的调控

1．2．4 鸽毛滴虫粘附蛋白的研究进展

1．3 AP65的研究

1．3．1 AP65

1．3．2 AP65作用机制

1．4 本研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 鸽毛滴虫虫株及试验动物

2．1．2 实验菌株与载体

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 主要设备及仪器

2．2 方法

2．2．1 主要试剂配制

2．2．2 鸽毛滴虫的分离培养

2．2．3 基因组DNA和总RNA提取

2．2．4 鸽毛滴虫AP65保守区克隆

2．2．5 5’RACE PCR和3’RACE PCR

2．2．6 鸽毛滴虫AP65序列确定

2．2．7 鸽毛滴虫AP65序列分析

2．2．8 检测是否存在其他鸽毛滴虫AP65

2．2．9 重组质粒的构建

2．2．10 TgAP65-2重组蛋白的表达纯化

2．2．11 TgAP65-2重组蛋白免疫制备多克隆抗体

2．2．12 鸽毛滴虫自然表达的AP65的鉴定

2．2．13 鸽毛滴虫AP65蛋白的虫体表面定位

3 结果与分析

3．1 鸽毛滴虫AP65基因的克隆鉴定

3．1．1 保守区克隆

3．1．2 两端序列克隆

3．1．3 获得全长序列

3．2 鸽毛滴虫AP65序列分析

3．2．1 序列比对

3．2．2 预测分析

3．3 其他鸽毛滴虫AP65型的检测

3．4 多克隆抗体的制备

3．4．1 真核表达载体的构建

3．4．2 重组蛋白的表达鉴定

3．4．3 多克隆抗体的制备与鉴定

3．5 虫体自然表达的AP65蛋白的鉴定

3．6 虫体表面定位

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

硕士期间论文发表情况